mRNA 疫苗及其作用机制的研究进展

孟子延，马丹婧 综述，高雪，李琦涵 审校

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室,云南昆明650118

1989 年,美国VICAL 公司首次将人工合成的RNA作为新型药物用于治疗肿瘤等疾病［1］；1990 年,有研究将裸mRNA 肌肉注射小鼠后,实现了相应蛋白质的表达［2］,证明体外转录(in vitro transcribed,IVT)mRNA 可传递遗传信息,从而在机体组织内表达蛋白质。mRNA 疫苗是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入人体,直接进行翻译,形成相应的抗原蛋白,从而诱导机体产生特异性免疫应答,达到预防免疫的作用。mRNA 疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗后的第三代疫苗,该疫苗具有针对病原体变异反应速度快、生产工艺简单、易规模化生产和安全有效性高等特点。研究表明,mRNA疫苗可诱导动物模型产生针对寨卡(Zika Virus)、埃博拉(Ebola virus)和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的免疫反应［3-7］。针对肿瘤的个性化人体试验证明,患者可对mRNA 疫苗产生 CD4+T 和 CD8+T 细胞应答［8］。

mRNA 疫苗在预防各类传染病过程中发挥了重要作用。由重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒病(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)正在全球蔓延,给人类生命健康和社会稳定带来了严重影响,接种疫苗是控制疫情暴发和病毒传播的有效手段［9-10］。截至2021 年2 月26 日,全球已有6 家公司或机构设计的mRNA 疫苗进入临床试验阶段,其中美国Biotech 公司与Pfeizer 公司等联合研发的 mRNA 疫苗 BNY162［11］和 Moderna 及Pfeizer 公司研发的 MRNA-1273［12］均显示出了良好的安全性和有效性,已获紧急使用批准。本文就mRNA 疫苗的免疫学特性、分子设计、递送系统、安全性的研究进展及其相应机制作一综述。

1 mRNA 疫苗的免疫学特性

抗原编码mRNA 可直接引发MHC-Ⅰ的呈现和细胞毒性T 细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)反应,这是mRNA 疫苗的关键优势之一。mRNA 允许抗原在细胞质中瞬时表达和积聚,随后这些抗原可被高效加工成多肽,并装载至MHC-Ⅰ类通路中。因此,胞浆中存在少量mRNA 就可确保将广泛的抗原提呈至CTL 细胞。MHC-Ⅱ类通路也可用mRNA 作为抗原来源,在mRNA 表达的蛋白分泌和循环后,直接将抗原从细胞质穿梭至溶酶体,也可在mRNA 结构设计中加入溶酶体靶向序列［13］。

研究表明,mRNA 传递可触发树突状细胞(dendritic cells,DCs)的抗病毒激活状态,其机制可能是涉及位于核内体的清道夫受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)和 TLR8 识别单链 RNA［14］。通过 RNA 二级结构的形成或在IVT mRNA 生成过程中引入双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)片段污染物,免疫激活可通过核内体的TLR3 途径激发；除了TLRs,dsRNA 还可激活胞质RNA 传感器视黄酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid inducible geneⅠ,RIGⅠ)和黑色素瘤分化相关蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5,MDA5)［15-17］。mRNA 分子结合这些危险信号传感器后,将通过特定的适配分子(如TLR7／8 的MyD88 分子和TLRs 的TRIF 分子)使信号分子下调,导致Ⅰ型干扰素(interferons-Ⅰ,IFNs-Ⅰ)和其他促炎因子,如白介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的产生；IFNs-Ⅰ结合自分泌和旁分泌受体,激活Janus 激酶信号转导转录激活因子(Janus kinase-signal transducer activator of transcription,JAK-STAT)通路,该通路可调节数百种参与抗病毒免疫蛋白基因的表达［18-19］。这些信号通路协调不同的先天和适应性免疫反应的激活和促进,被称为mRNA 的“自佐剂效应”。

2 mRNA 疫苗的分子设计原理

IVT mRNA 的基本结构与真核mRNA 较相似,包括1 个蛋白编码的开放阅读框(open reading frame,ORF)及其两侧的5′和 3′非翻译区,即 5′末端的 1 个7-甲基鸟苷帽子结构和 3′端的 1 个 100 ～ 250 bp 的poly(A)尾巴。非编码结构特征在mRNA 的药理作用中起着重要作用,可进行单独优化,以调节mRNA 的稳定性、翻译效率和免疫原性［20-21］。

2.1 mRNA 中核苷酸类似物的设计 mRNA 核苷酸自然发生的翻译后修饰在一定程度上阻止了内源性mRNA 的免疫监测,使细胞能够区分内源性mRNA与病理性或入侵性mRNA。这为mRNA 疫苗的开发提供了新的思路,即通过合并修饰核苷来降低免疫刺激的产生,因此也提高了安全性。IVT mRNA 中用假尿苷替代鸟苷可降低2′-5′-寡腺苷酸合成酶的活性,该酶可通过RNaseL 酶调节mRNA 的切割；另外,与mRNA 翻译过程抑制相关的蛋白激酶R 活性较低,使 mRNA 的表达增强。KORMANN 等［22］研究表明,用加入25%硫脲苷和25%的5-甲基胞苷进行核苷修饰mRNA,其编码促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)2 周后,产生的EPO 水平提高了5 倍；未修饰的mRNA 编码的EPO 水平未发生显著变化,仅引发了实质性的免疫激活。使用核苷类似物合成转录产物的大部分TLRs 均不再被激活,有研究表明,使用核苷类似物后,mRNA 翻译效率增加或稳定性升高的同时,免疫原性有所降低［23-24］。

2.2 5′和 3′端非翻译区(untranslated regions，UTRs)的设计 除了加入核苷类似物之外,优化mRNA 的ORF 和UTRs 序列,如丰富GC 含量或选择长寿mRNA分子的UTRs,也可强化mRNA 的表达,增加mRNA的翻译能力和稳定性［25-27］。mRNA 的 5′和 3′UTRs 可显著影响mRNA 的转译率和半衰期,因此优化UTRs可能是提高mRNA 转译率和延长mRNA 半衰期的有效途径［28-31］。有文献报道,由于稳定的二级结构可能阻碍核糖体结合起始编码复合物,5′UTRs 区域必须短而松散［32］。有研究使用一个基于细胞培养的系统过程来识别新的UTRs,显著增加了IVT mRNA的蛋白表达［33］。与人类 β-珠蛋白 3′UTRs 比较,有些3′UTRs 序列可诱导产生约高3 倍的蛋白。研究表明,与携带 β-珠蛋白 3′UTRs 的 mRNA 比较,携带新3′UTRs 基序的mRNA 疫苗在接种和基因重编译研究中可诱导更有效的治疗效果［33］。

2.3 Cap 结构的设计 mRNA 的Cap 结构与其稳定性密切相关,Cap 结构通过与真核翻译起始复合因子eIF4E结合,从而调节mRNA 翻译效率。加Cap 结构后mRNA 5′端缺失末端游离磷酸基团,对碱性磷酸酶较稳定,且Cap 结构能够封闭磷酸酯键上游离的2′OH 基团,从而对部分 RNA 酶(T2、T1、A)较稳定。抗反转帽(anti-reverse cap,ARCA)修饰可确保5′末端的正确定位,产生几乎完整的mRNA 片段,从而有效结合核糖体［34］。其他Cap 修饰,如硫代磷酸Cap类似物,可进一步提高与起始因子eIF4E 的亲和力,增加对RNA 脱帽复合物的抗性［35-36］。传统加Cap 的方法为酶加帽法(在制造过程中添加额外的反应组合纯化步骤)［37］及与Cap0 共转录加帽法(该方法有可能导致dsRNA 的产生,从而激活先天性免疫)［38］。CleanCap®在IVT 期间向特定的转录起始序列添加了一个自然的 5′Cap1 结构［39］,使一步法生产 mRNA疫苗成为可能。

2.4 Poly(A)尾的设计 3′端Poly(A)尾是除了5′端Cap 结构外对mRNA 稳定性起重要作用的结构,mRNA 的降解大多数从Poly(A)尾端开始,先将Poly(A)尾结构经脱腺苷化作用缩短为寡A 尾,再通过一系列反应除去5′端Cap 结构,从而完成核糖核酸外切酶对mRNA 的降解。mRNA 的Poly(A)尾的伸长与表达持续时间相关,研究表明,3′UTR 的特异性修饰可通过影响脱腺苷率而减缓Poly(A)尾的衰变［40-41］。通过将基因片段上加尾巴序列的方法在mRNA 分子上添加Poly(A)尾,也可利用Poly(A)尾的多聚酶在IVT 后延伸mRNA 分子进行加尾。前者具有确定的长度,潜在的安全性风险较小,是疫苗开发更好的选择［42］。据报道,Poly(A)尾长度的增加可提高形成多聚体的几率,最适宜的Poly(A)尾长度位于120 ～150 bp 之间［43-45］。

3 mRNA 疫苗的递送系统

mRNA 疫苗原位靶向抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)有许多优点,但将mRNA 输送至靶细胞尚需克服诸多技术障碍。裸mRNA 疫苗能够成功表达,但易受酶的影响,发生降解,采用纳米载体制备的mRNA 可更好地抵御酶降解,使静脉注射等新的递送途径成为可能［46-48］。脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNPs)是目前最先进的递送系统,在siRNA的传递中证明是安全有效的［49-50］,近期的新冠疫苗大规模临床试验表明,LNPs 作为mRNA 的递送载体,其安全性和递呈效果较理想［9-10］。

3.1 LNPs 递送系统的研究策略 经mRNA 递送测试的脂质配方通常由阳离子／ 离子化脂质和其他辅助脂质(如磷脂、胆固醇和 ／ 或聚乙二醇脂质)组成。阳离子类脂类用于负电荷mRNA 分子的静电络合,辅助脂质由于其独特的功能特性可能会影响复杂的mRNA LNPs 的结构排列,从而提高其稳定性和促进mRNA LNPs 的细胞内摄取和胞质进入［51］。细胞内吞的mRNA LNPs 在核内体降解是影响整体转染效率的关键因素之一。有研究表明,mRNA 的核内体释放机制依赖于LNPs 的质子化(即电离)脂质和核内体膜的阴离子磷脂混合步骤［52］。这些脂质间离子对的形成会引发膜融合和膜失稳,反而增强了mRNA 分子从核内体的逃逸。

另一种mRNA LNPs 的产生策略是乙醇稀释,这是一种适用于制备更先进的含电离性脂质LNPs 体系的方法。将单个脂质溶解在乙醇中,在酸性缓冲液中可与mRNA 快速混合,通过稀释乙醇相,脂质进行缩合过程,形成LNPs 的同时有效地包裹mRNA。随后的渗析步骤进行中和缓冲液,以去除乙醇和中和pH。研究发现,通过调节不同脂质的摩尔比,形成具有多种不同表面特征的mRNA LNPs,利于D-Lin-MC3-DMA 脂质(pH 依赖的电离性脂类)从内核至表面部分分离的LNPs 组分与提高转染效率有关［53］。

3.2 mRNA LNPs 的体内转染 膜融合理论的研究已有十几年的历史,但LNPs 促进mRNA 胞浆的传递机制尚未明确［54］。近期研究表明,mRNA LNPs 的内吞转运是一个动态过程,涉及到的机制包括mRNA进入胞浆和翻译的循环通路及信号通路,如位于晚期内溶酶体上的转运蛋白Niemann-Pick C-1 型,其负责大量内化(si)RNA-LNPs 的胞吐,大幅降低了胞质传递,雷帕霉素复合物1 的机械靶点向溶酶体膜募集是触发所传递mRNA 翻译的关键［55］。细胞进入机制和细胞内mRNA 转运之间关系的研究较少,但该项研究较重要。有研究表明,通过靶向mRNA LNPs至DCs 表达的选择性表面受体,可将颗粒引导至对mRNA 递送降解程度较低细胞内的运输途径上［56］。

4 mRNA 疫苗的安全性

mRNA 疫苗除了具有DNA 疫苗能够胞内表达抗原的优点外,还克服了其免疫原性低、可能产生抗载体免疫的缺点,且无整合进宿主DNA 的风险。但随着研究的深入,发现mRNA 疫苗的自佐剂效应可能带来潜在的安全性风险。IFNs-Ⅰ参与免疫耐受调节,可促进自身反应性B 细胞和T 细胞的发育,对机体免疫系统构成威胁［57-58］。前期临床试验发现,受试志愿者中自身免疫常见诊断指标升高的比例达20%［59］,也出现了与自身免疫病有关的贝尔氏麻痹(一种暂时性面瘫)病例［60］,如注射 BNT162b2［61］。这种IFNs-Ⅰ信号生产的影响与mRNA 疫苗设计的相关性尚需进一步研究。

5 小结与展望

随着研究的不断深入,mRNA 疫苗技术已日趋成熟。有证据表明,mRNA 疫苗的保护效果［9-10］优于同种病毒的灭活疫苗［62-64］、亚单位疫苗［65-66］和病毒载体疫苗［67-69］。目前,LNPs 用于 mRNA 的局部和全身传递已成为一种趋势,其中跨越细胞内外屏障的作用机制尚需进一步研究,有望实现有针对性地提高mRNA 的整体转染能力。在遭遇突发新发传染病时,mRNA 疫苗能迅速实现从研发到生产的目的,当其安全性和有效性指标符合法规监管要求时,将是一种良好的应急选择,可及时保护易感人群。虽然有mRNA疫苗相关的贝尔氏麻痹的报道,但发生几率极低；另外,mRNA 疫苗大规模用于人体的时间尚短,需进行长期不良反应监测,以验证其安全性及有效性。