纳米材料靶向血栓多模态显像及溶栓治疗研究进展

郑广荣，王洪津

大连医科大学附属第二医院 神经内科，辽宁 大连 116023

血栓是引发缺血性脑卒中及心肌梗死的主要病因[1]。脑卒中是我国单病种中发病率、病死率和致残率最高的疾病，给社会、家庭和患者带来了沉重的经济负担和巨大痛苦[2-3]。缺血性脑卒中在临床中的治疗原则为早诊断、早治疗、早康复和预防再发，而早诊断则依赖于影像学的辅助，如超声、计算机断层扫描(computed tomography，CT)、数字减影血管造影(digital subtraction angiography，DSA)及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等。但这些传统的成像技术对于血栓疾病诊断的特异性及敏感性较低，常错过黄金诊治期，对患者的预后极为不利。分子影像学(molecular imaging，MI)是将分子生物学与医学影像学相结合，从细胞和分子水平对病灶进行定性和定量的可视化研究，着力于探测疾病发生发展的分子生物学基础，其核心要素是高分辨成像设备和高灵敏度、高特异性的靶向探针[4]。Torchilin[5]提出了靶向治疗的概念，即定向递送包裹药物的纳米粒实现精准释放治疗，而靶向递送、释放、治疗效果则由MI来监控。这种利用不同纳米材料合成出多种靶向显像剂，且可以成立多种递药系统的新手段，为血栓疾病早期的精准诊断及治疗提供了新思路。现就血栓靶向成像及治疗的研究进展进行综述。

1 物理靶向

1.1 磁性靶向 Inada等[6]将磁性靶向给药系统与尿激酶偶联运用于血栓治疗，其具有较强的纤维蛋白溶解活性，该磁性纳米粒在外部磁场的引导作用下能精准到达血栓部位，释放尿激酶进行溶栓治疗。在前者研究的基础上，Torchilin等[7]及Bi等[8]使用氧化铁分别与链激酶、尿激酶结合，制备成相应的磁性靶向纳米粒，该磁性靶向纳米粒的溶栓效率明显高于传统药物注射溶栓；此外，磁性纳米粒的靶向作用降低了全身性纤溶酶原激活和继发的血浆纤维蛋白原降解，从而降低溶栓药物的不良反应。

超顺磁性氧化铁纳米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)的出现为纳米材料提供了新选择。Heid等[9]合成了由葡聚糖作为外壳的SPIONs，并将不同浓度的组织型纤溶酶原激活剂(tissue type PA，tPA)固定在纳米颗粒上，通过外部磁场引导tPA到血栓部位进行溶栓治疗。SPIONs除了可以完成传统的磁靶向及药物递送外，还可用于MRI成像，对治疗效果进行监控。姚琼[10]利用SPIONs为基础材料对小鼠的颈动脉斑块进行MRI成像，可以清晰地观察到治疗前后颈动脉斑块处变化。

Cheng等[11]利用磁性纳米载体具有的机械搅拌作用，制备出可以磁性活化的镍纳米棒，并将tPA溶液与磁性镍纳米棒悬浮液混合，通过外加旋转磁场来远程旋转镍纳米棒。在外加磁场的作用下产生的机械搅拌力加速tPA在纤维蛋白表面的迁移扩散，从而较低药物浓度的tPA即可获得有效的溶栓效果。Tasci等[12]利用氧化铁和tPA制备“胶体涡轮”，通过搅拌作用在血栓块表面产生一定的穿透力，破坏局部血栓，同时将“胶体涡轮”中所携带的tPA释放，更有利于其渗入血栓中，更好地溶栓。

1.2 剪切力靶向 血液流动时与血管内壁产生的摩擦力称作剪切力，正常血管内壁光滑，管径均匀，剪切力约为1.5 Pa[13-14]。血小板(platelet，PLT)具备一定的剪切力敏感性。血栓形成的血管狭窄使局部血管剪切力升高10～100倍，剪切力的骤然升高促使PLT加速聚集，其表面形成膜链结构。聚集后的PLT经过剪切力减小的部位时，膜链重组，PLT聚集强度及稳定性增加，促进血栓生长并加固血栓稳定性[15-16]。

Korin等[17]利用血栓区域剪切力的变化，制备出基于剪切力激活纳米治疗系统(SA-NTs)，利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)为仿生材料制备出类似PLT大小的纳米泡，在内部标记荧光，通过体外三维流体模型模拟90%血管狭窄时，狭窄区域产生明显荧光，证明制备的纳米泡具有相应的剪切力靶向作用。将tPA通过碳亚二胺法连接至纳米泡上合成出的SA-NTs对血栓具有较好的靶向性和治疗效果，其潜在优势在于降低药物剂量，更好的保证安全性。柯琴[18]应用功能性磷脂1,3-二棕榈酰胺磷脂酰胆碱为基础材料，合成剪切力敏感型脂质体(shear-stress sensitive liposomes，SSSL)，脂质体的化学结构与血小板膜更为相似，具有较好的剪切力靶向作用，同时也拥有更高的生物安全特性。在体外及小鼠肠系膜动脉血栓模型中均验证了SSSL拥有较强的血栓区域靶向作用。

2 化学修饰靶向

2.1 血小板靶向 PLT是止血和血栓形成的关键细胞，其表面具有多种糖蛋白，这些特异性糖蛋白被广泛用于血栓的靶点。血小板GPIIb/IIIa受体(CD41/CD61)，也称为整合素αIIbβ3，是PLT表面表达最丰富的受体。活化的PLT可以通过整合素αlIbβ3与纤维蛋白原之间的桥联作用进行聚集，使血栓快速变大。Huang等[19]合成了RGT多肽分子，并证实该多肽分子可以较好地靶向c-Src/β3，这提示c-Src/β3可以成为抗血栓形成的靶点。Wang等[20]构建出单链抗体(scFvs)，其可以特异性结合血小板上高表达的整合素αIIbβ3，将重组单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(scuPA)与scFvs结合，制备出兼具诊断与治疗功能的超声造影剂，该新型造影剂对血栓具有较高的靶向性，超声监控下直观其溶栓效果与尿激酶类似，同时避免了传统尿激酶延长出血时间的不良反应。

血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa受体也是PLT活化的一种生物标志，可作为纤维蛋白原的α链和γ链的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列的结合受体。Schumann等[21]利用RGD修饰脂质体微泡，构建出靶向血栓的超声造影剂，该造影剂增加了剪切力较低及血液流速较慢区域的血栓靶向能力。Hua等[22]及Mu等[23]分别将tPA和尿激酶包裹进表面有RGD肽段修饰的超声造影剂中，进行体外靶向溶栓。Wang等[24]将连接有RGD肽的壳聚糖膜(chitosan,CS)修饰于包裹溶栓药物的PLGA纳米粒表面，同样可实现靶向溶栓。Tang等[25]证实，相比线状RGD，环状RGD(cRGD)对激活的血小板GPIIb/IIIa受体有更强的靶向性。周君[26]利用cRGD的靶向能力，合成Fe304-PLGA-rtPA/CS-cRGD，呈多层球形结构，外层CS-cRGD具有较强的靶向血栓能力，而其内包裹的超顺磁性Fe304为病灶的MRI监控提供了可行性，球体结构的核心区域rtPA提供溶栓功能。

P-选择素糖蛋白在血栓形成中具有重要意义，可作为早期血栓的检测标记[27]。Juenet等[28]提出，岩藻依聚糖可以作为P-选择素的多糖配体，靶向识别血栓中的PLT。利用岩藻依聚糖修饰的仿生纳米粒表面共价结合rtPA，具有良好的血栓靶向特性，合成的纳米粒对血栓具有良好的治疗效果。将同位素标记的岩藻依聚糖制成纳米材料，利用单光子发射计算机断层扫描显影技术追踪纳米粒靶向血栓，为今后的溶栓治疗提供了新的方向。

2.2 纤维蛋白(原)靶向 纤维蛋白参与所有类型的血栓形成，是血栓形成的重要组成成分，且游离血液中含量较低，可成为血栓的一种靶点[29]。肿瘤间质纤维蛋白的归巢肽(cys-arg-glu-lys-ala，CREKA)能与血管中凝固血浆的纤维蛋白特异结合[30]。Song等[31]将CREKA结合在荧光标记的SPIONs表面，制备能同时应用于MRI及近红外荧光成像的造影剂，其能更好地检测出微血栓的存在。Zhong等[32]利用CREKA的靶向能力制备出Fe3O4-PLGA-PFH-CREKA纳米粒，兼具MRI造影剂及溶栓治疗功效，该研究创新性地使用相变材料PFH，可以在超声等装置激发下产生物理相变，释放能量击碎血栓。

GPSRPP及GPRPP多肽对纤维蛋白具有高亲和力。McCarthy等[33]设计了交联葡聚糖包被的氧化铁(CLIO)纳米颗粒，并分别在纳米粒表面修饰可以靶向到纤维蛋白的多肽GPRPP及GPSRPP，这两种多肽修饰的纳米粒均对血栓具有较强的靶向能力，且CLIO-多肽GPRPP是CLIO-多肽GPSPP靶向能力的1.6倍。与cRGD相似，环状的多肽可以提高受体和肽段的亲和性及稳定性。Rezaeianpour等[34]利用二硫键将GPRPP环化，同时将直肽和环肽缀合Tc-99m，证实其显影效果优于连接直肽的造影剂。 凝血因子XIIIa是血栓形成早期急性血栓形成的标志。McCarthy等[35]在CLIO表面修饰可以靶向到纤维蛋白的短肽配体(F XIII)，并通过聚乙二醇(PEG)连接溶栓药物(如tPA等)，得到CLIO-F XIII-PEG-tPA，结果表明，F XIII靶向纳米制剂可以靶向新生的血栓凝块并溶解血栓。此外，Kim等[36]设计了由PEG壳聚糖修饰的金纳米粒作为载体，结合了靶向纤维蛋白的多肽链的新型CT造影剂，其在血栓区域表现为明显的高密度影，这不仅能直接检测脑血管的栓子，及时检测和量化脑血栓，还能指导和监测溶栓治疗，反映组织情况。

2.3 凝血酶靶向 区分新鲜和陈旧性血栓有助于临床对血栓性疾病的诊治。凝血酶是血栓形成的关键之一，且仅在新鲜血栓中存在。Ta等[37]设计出能区分栓龄的智能型T1/T2双序列MRI造影剂(以氧化铁为核心，Gd-DTPA与靶向纤维蛋白的多肽连接)，当遇到新鲜血栓时，凝血酶分解掉剪切性多肽，血栓区域有T1信号而无T2信号；遇到陈旧性血栓时，该区域显示T2信号，而无T1信号，这种智能型检测血栓的方式可作为未来的研究方向。同时，Kwon等[38]开发了一种新的靶向活化凝血酶的荧光肽(TAP)，将TAP与包覆硅的金纳米颗粒结合后制备出一种新型纳米粒(TAP-SiO2@AuNPs)，该纳米粒具有良好的荧光淬灭作用，可以近红外荧光成像。凝血酶存在时，荧光强度比没有凝血酶存在时高30.31倍，这是由于淬灭的TAP分子在金纳米粒子表面的血栓特异性裂解，而CT可以直接显示该新型纳米粒靶向血栓。

3 生物靶向

血栓形成及抗血栓过程极其复杂，物理及化学修饰的靶向血栓纳米粒仍存在一定的局限性，如靶点单一、生物安全性不够高、机体排异、形态及柔软度不够等问题。PLT能向血管边缘及损伤处运输集结，是天然的靶向血栓的载体。Anselmo等[39]利用仿生的设计思路，以PEG纳米颗粒为原材料制备出与天然PLT形态相似的中空内芯柔软圆盘状颗粒材料，并在其表面修饰胶原结合肽、vWF因子结合肽和线性纤维蛋白原模拟肽。在3种肽协同介导下的纳米粒能稳定的靶向并黏附血栓，起到较好的靶向及溶栓作用。多肽介导系统的加入也大大增加了仿PLT形态纳米粒的靶向能力。

人工制备的仿生PLT虽然可以在一定程度上降低机体的排异，增加靶向性，但仍无法与天然的PLT膜媲美。天然的PLT膜表面有更多的信号识别分子，可以逃过机体的免疫屏障，与血栓部位细胞及蛋白等多种物质发生复杂的生物化学作用。Hu等[40]分离血液中的PLT，通过反复冻融制得所需PLT膜，在其内部包被PLGA纳米粒，制成PNPs仿生纳米粒，其表面为天然的PLT膜，保留有多种具有识别及黏附功能的蛋白类物质，高仿生性使其生物相容性及靶向性均有巨大提升。陈文婷[41]利用介孔材料负载量大的特点，在介孔氧化硅空洞中吸附Fe3O4制得载Fe3O4空心介孔氧化硅囊(OSNCs)纳米粒，并利用PLT的吞噬功能标记PLT；体内实验发现，注射OSNCs@PLT组的大鼠MRI成像效果明显高于OSNCs和纯PLT组，这说明利用PLT靶向血栓成像的设想是可行的。该实验结果对未来利用OSNCs@PLT内空腔载入溶栓药物进行溶栓治疗提供了可能。

4 总结与展望

纳米材料靶向血栓成像及溶栓治疗的早期研究主要着重于材料的靶向性，对靶向能力的探索则相对较少。较早的磁性纳米粒对血栓有一定的靶向作用，但这种被动靶向机制使其寻靶力较低，病灶显像及治疗效果欠佳，且受限于受病灶位置深度。随着研究的不断深入，对血栓中的血小板、纤维蛋白及溶血酶的靶向研究逐渐被关注。利用血栓本身的生物化学特性，在纳米粒的表面连接肽链等靶向分子，一种以抗原-抗体结合为主要连接方式的主动靶向方式被广大学者接受。与被动靶向方式比较，主动靶向的纳米粒拥有更高的寻靶力及精准度。虽然化学修饰的纳米材料在进行不断的优化，兼具一定的生物安全性，但与天然生物源性细胞膜相比仍存在差距。而仿生性及生物安全性更高的纳米材料，如脂质体、血小板膜等，这种生物方法修饰的新型生物靶向纳米材料拥有几乎全部的血栓靶向分子，且其可以轻松逃避免疫系统，起到强靶向、高载药、高显像、高溶栓的作用。这种生物靶向的方式也将成为未来对血栓早预防、早诊断、早治疗的新方向，值得深入研究。