金黄色葡萄球菌致新西兰兔脓胸模型的建立以及尿激酶和脱氧核糖核酸酶Ⅰ的作用研究*

李金垄，梁晋华，张真强，王 可

（广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，南宁 530021）

脓胸是胸膜间隙内脓液的积聚，通常为肺部感染继发肺旁积液的并发症。尽管医疗进步，脓胸依然与高发病率和死亡率有关，大约有10%～20%的脓胸患者接受了适当的医疗治疗，最后仍然死亡[1-3]。脓胸的主要细菌包括有金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌等[4]，其中金黄色葡萄球菌是全世界报告的最常见的脓胸感染微生物[1,5]。脓胸的治疗是多样化的，胸腔引流和纤融治疗是脓胸常见的治疗方法[1,6-8]。然而，有研究表明，即使胸腔引流联合抗生素治疗脓胸，胸腔引流依然有一定的治疗失败率[9-10]。一方面，近几年研究发现，致病菌耐药性在不断增加；另一方面，脓胸患者住院时间长，胸腔引流管放置时间较长，可能引起引流管类似于血管移植物上的细菌生长[11-12]。

脓胸的标准治疗由抗生素和胸腔积液的引流组成；当脓毒症和感染性胸腔积液得不到有效控制时，需要进行手术。数据表明，胸膜内给药纤溶药物通过切割胸膜内纤维蛋白间隔和改善胸管引流可以减少失败的引流和随后的手术频率[13-14]。此外，胸膜间隙中细胞外DNA和其他细菌成分的存在可能增加胸腔积液黏度，应用脱氧核糖核酸酶I（DNase I）可能会改善这种情况[15]。因此，本实验选用金黄色葡萄球菌作为实验菌株，通过建立金黄色葡萄球菌新西兰兔脓胸模型，进一步探究尿激酶和DNase I对胸腔内粘连和纤维蛋白形成的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 普通级雄性新西兰兔16 只，体重2.2～2.8 kg，由广西医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK 桂2014-0003，动物生产许可证号：SCXK 桂2014-0002。饲养条件：室温25 ℃，适宜湿度，空气流通，动物自由摄食、饮水。本研究符合广西医科大学第一附属医院实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准。

1.2 主要仪器和试剂 LB 肉汤（北京陆桥公司）；LB 琼脂粉（北京陆桥公司）；苏木精－伊红（HE）染色试剂盒（索莱宝）；戊巴比妥钠（SIGMA）；多功能酶标仪（Thermo Fisher 3020）；一次性输液用头皮针管（湖南康利莱医疗器械有限公司）；冷冻离心机（HERMLE Z326K）；超低温冰箱（Thermo 995），漩涡振荡器；分光光度计（普析通用T6）；超净台（苏州净化）；生物安全柜（苏净安泰BHC-1300IIA2）；生化培养箱（恒宇SPX-300-II）。

1.3 菌液的制备 本实验所用菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923，储存于含25%甘油的LB 肉汤培养基中，置于-80 ℃冰箱保存。挑取部分-80 ℃菌液接种至LB琼脂培养皿中，37 ℃生化培养箱培养16～18 h。然后挑取单个菌落接种于LB 肉汤液体培养基中，37 ℃，210 r/min摇床过夜培养14～16 h。低温离心机3 000 r/min离心15 min，弃上清液，使用PBS缓冲溶液洗涤，重复3 次。调OD450=0.550（菌量为109CFU/mL），用LB 肉汤稀释成108CFU/mL，使用菌落计数法验证菌液浓度。

1.4 实验分组及新西兰兔脓胸模型的建立 将16只新西兰兔随机分为实验组（n=6）、用药组（n=6）和对照组（n=4）。实验组新西兰兔在耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉新西兰兔，左侧卧位固定，剃毛备皮，定位于右侧胸壁第6肋间脊柱前2～3 cm，碘伏消毒铺巾，皮肤切口约1 cm，通过镊子进行穿刺，置入剪除针头的6号灭菌一次性输液针管，观察导管是否随呼吸运动以证实导管是否进入胸腔。用无菌注射器抽气，排出穿刺时可能进入胸腔的气体，然后胸腔按2 mL/kg 体重注入108CFU/mL上述菌液，并再注入1 mL 无菌生理盐水冲洗导管。将输液针管去除盖帽端后置入胸腔内，缝合穿刺部位皮肤。待兔子苏醒后送回普通级饲养区兔笼，给予水和食物。用药组注入菌液后，再向胸腔注入1 mg DNase I（上海，索莱宝生物科技有限公司，D8071-25，25 mg）和4 mg 尿激酶（上海，昀冠生物科技有限公司，U108373-10，10 mg）；对照组新西兰兔右侧胸腔注入2 mL/kg的LB肉汤，其它操作与实验组一致。

1.5 动物处理 实验第4 天，所有实验动物均经耳缘静脉滴注戊巴比妥致死。观察兔子胸腔大体观，无菌操作下取样，收集胸腔积液、胸膜组织及胸腔引流管。

1.6 脓胸模型的验证 取胸腔积液，分析胸腔积液中的白细胞数、乳酸脱氢酶（LDH）、葡萄糖和pH值（深圳迈瑞生化分析仪BS-2000）。金黄色葡萄球菌脓胸模型建立标准：胸腔积液标本明显化脓，革兰染色阳性，或葡萄糖＜2.3 mmol/L（正常范围：4.1～5.9 mmol/L）、pH＜7.10、LDH＞1 000 U/L。

1.7 胸膜粘连评分 由两位不知实验分组的人员进行胸膜评分：0分：正常肺和胸膜腔；1分：脏、壁层胸膜间1～3条粘连条带；2分：胸膜腔内3条以上粘连条带，或少量纤维蛋白沉积；3 分：胸膜腔内多处区域散在粘连条带，或存在较多纤维蛋白沉积；4分：胸膜腔因粘连而闭合（分离出血），或存在大量纤维蛋白沉积。

1.8 胸膜病理检查 取各组右侧胸腔膈肌层胸膜组织，10%甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋、切片，行HE 染色，光镜下观察胸膜病理变化，并测定胸膜厚度。

1.9 胸腔留置导管的处理 开胸后，使用灭菌器械剪开取出胸腔内留置导管，无菌生理盐水冲洗导管内外表面，并去除导管表面黏附物。每个样本取3 cm长的导管，剪成小段，放入装有2 mL生理盐水的无菌试管中，使用漩涡震荡仪震荡10 min，取导管震荡液稀释100倍或1 000倍后稀释涂盘，培养24 h后进行活菌计数，结果记作lg（CFU/mL）。

1.10 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脓胸模型评估 3组均无动物死亡。实验期间，与对照组相比，实验组饮食和饮水稍减少，排便正常，精神萎靡，活动减少；用药组无明显变化。本研究建立脓胸模型12只，术后4 d抽取胸腔积液，实验组胸腔积液混浊，革兰染色发现阳性菌，胸膜腔内较多纤维蛋白沉积，胸膜腔内大量粘连条带；用药组胸腔积液稍混浊、量少，革兰染色发现阳性菌，胸膜腔内纤维蛋白沉积和粘连条带明显减少。实验组和用药组胸腔积液pH＜7.1，LDH＞1 000 U/L，符合脓胸标准。对照组胸腔内无明显胸腔积液、脓絮状物及粘连，胸膜表面光滑，见图1。

2.2 实验组和用药组胸腔积液各指标比较 用药组白细胞数显著少于实验组（P＜0.05），两组LDH、葡萄糖和pH 值比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 实验组和用药组胸腔积液各指标比较

表1 实验组和用药组胸腔积液各指标比较

与实验组比较，*P＜0.05。

2.3 3组胸膜粘连评分和胸膜厚度比较 实验组和用药组胸膜粘连评分和胸膜厚度均明显低于对照组（P＜0.05），用药组胸膜粘连评分和胸膜厚度均明显低于实验组（P＜0.05），见表2。

表2 3组胸膜粘连评分和胸膜厚度比较

表2 3组胸膜粘连评分和胸膜厚度比较

与实验组比较，aP＜0.05；与用药组比较，bP＜0.05。

2.4 胸膜组织病理检查 与对照组相比，用药组和实验组胸膜均不同程度增厚，并伴有炎性细胞浸润；与用药组比较，实验组胸膜明显增厚，炎性细胞浸润明显增加，可见较多胶原组织沉积，见图2。

2.5 胸膜腔留置导管的菌落计数 用药组胸膜腔内导管菌落数量（4.7±0.48）与实验组（5.12±1.01）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组胸膜腔内导管未培养出细菌。

图2 新西兰兔脓胸膈肌面胸膜HE染色图（×100）

3 讨论

国外关于脓胸动物模型研究已有大量报道，多数应用新西兰兔进行实验，因为目前诱导脓胸形成多数必须先人为造成无菌性炎症，小型动物(如小鼠和大鼠)往往无法耐受，在脓胸形成之前即死亡。兔体形稍大，对炎症有较好的耐受性[16]。因此，本研究选用新西兰兔作为实验动物。此外，也有文献报道用兔致病菌巴斯德杆菌直接诱导脓胸，然而该模型多用于脓胸诊断和治疗的研究，难以用于其他细菌与脓胸的相关研究[17]。本研究建立了一种引流管相关的金黄色葡萄球菌脓胸模型，为进一步研究金黄色葡萄球菌与脓胸及引流管之间的发生和发展提供可能。

在之前的研究中，笔者用铜绿假单胞菌成功建立了引流管相关脓胸模型[18]，本实验采用了类似的方法。该模型的主要优势：（1）脓胸的形成是一致性的，无需先诱导无菌性胸膜炎；（2）金黄色葡萄球菌是引起人脓胸的主要致病菌，也是兔子的常见致病菌，符合临床实际情况；（3）本研究可以对胸腔导管进行研究，为临床研究细菌和胸腔引流管之间的密切关系提供了可能。尽管实验中所使用的金黄色葡萄球菌是强力致病菌，但在不使用抗生素的情况下，兔子依然能够存活并形成脓胸。

在最初的试验中，笔者尝试了在胸膜间隙放置引流管，然后将其固定在肩胛区的皮下组织中，但是失败了。一方面，可能形成大量纤维蛋白隔膜，阻碍积液的引流，也阻止穿刺伤口的愈合，增加污染机会，使兔子死亡率增加；另一方面，体外留置引流管不利于兔子管理，兔子可撕咬导管而造成导管脱出，而固定兔头影响其正常生活导致兔子更易死亡。因此，实验中笔者将引流管完全置入胸腔中以模拟胸腔引流导管长时间留置，观察引流管在脓胸胸腔中的情况。

已有研究表明，在长期留置于体内的替代性治疗移植物中存在大量的细菌[19]，且在多数动物模型中均已证实了这一点，这与本研究的结果一致。实验处死兔子后，笔者将胸腔内导管取出，用生理盐水冲洗导管内外表面。然后，取部分导管剪碎放入生理盐水中，将其震荡，用该生理盐水进行培养，发现震荡后液体中可培养出大量细菌，证明了脓胸中金黄色葡萄球菌能够黏附在导管上生长。在临床上，部分进行闭式胸腔引流治疗的患者会出现迁延不愈，甚至发展为慢性脓胸的情况，这除了与患者自身的生理状况和耐药金黄色葡萄球菌等有关外，是否也与金黄色葡萄球菌能够在导管表面黏附生存有关，这一点尚未有明确报道。对于脓胸中引流管表面存在的细菌能够存活多久，笔者进行了一次试验，发现即使在造成脓胸后60 d导管表面仍然存在有大量细菌，而此时胸腔内部感染已基本被清除了。提示引流管可能为细菌提供了一个庇护所，使细菌能够躲避宿主的免疫清除，进而长期存活于宿主体内。

最后，笔者利用该兔脓胸模型研究了尿激酶和DNase I 联合应用对兔脓胸的影响。自1940年以来，针对脓胸的纤溶治疗一直被提倡，并且仍然是当今脓胸治疗武器的一部分[20]。然而，2005年的一项研究评估了链激酶治疗脓胸的临床相关终点，发现链激酶在死亡率、手术率、影像学结果或住院时间方面均无益处[21]，而另一项在儿科脓胸患者中进行的随机研究表明，采用尿激酶纤溶酶原激活剂进行胸膜腔内纤溶治疗的效果与胸腔镜一样好[22]。另一方面，DNase I 可以减少细胞外DNA 和其它细菌成分，从而降低胸腔积液的黏度[15]，常与纤溶酶原激活剂联合用于治疗脓胸。国外关于纤溶酶原激活剂联合DNase 治疗脓胸已有较多报道，通常应用的是阿替普酶。因此，本实验选用了尿激酶，观察其联合DNase 治疗兔脓胸的疗效。本研究发现这两种药物联合应用确实可以有效的减少纤维蛋白的沉积和胸膜粘连。然而，遗憾地是，联合应用尿激酶和DNase I似乎并未能有效减少胸膜腔留置导管上的细菌量，对脓胸相关的胸腔积液也未发现明确的作用意义。在本次脓胸模型中，尿激酶联合DNase治疗观查到了明显的胸膜厚度和炎症减轻，然而Idell等[13]关于尿激酶治疗脓胸的研究认为尿激酶并不能使脓胸相关的胸膜厚度和胸膜皮减轻。笔者认为造成这种差异的可能原因是治疗方案并不完全相同，笔者采用的是尿激酶联合DNase，而Idell等[13]单用尿激酶治疗。

本研究存在的局限性：本研究模型与多数脓胸患者的通常情况不同，因为大多数脓胸患者都具有潜在的肺炎，而在本模型中，原发感染在胸膜腔内；本研究动物样本量较少；本次实验仅对尿激酶和DNase I的联合应用进行了研究，未设置单用尿激酶或DNase I 的对比研究，这两种药物对脓胸的具体效用仍有待研究。

综上所述，通过向新西兰兔胸腔中直接注入高浓度金黄色葡萄球菌悬浮液，并植入引流管，成功建立了金黄色葡萄球菌新西兰兔脓胸模型，并证实了引流管上存在大量细菌；早期尿激酶和DNase I联合干预脓胸可以有效减少胸膜腔内纤维蛋白沉积和粘连。