青蒿琥酯对伴牙周病I型糖尿病大鼠脑组织病变及TNF-ɑ、Caspase-3表达的影响*

马楚彬，农晓琳，陈 怡，梁 晨

（广西医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，南宁 530021）

糖尿病(DM)是一种代谢紊乱疾病，它通过一定的机制直接或间接影响大脑和行为反应。许多证据表明，DM 患者面临严重的脑并发症[1]。近年来，牙周炎与DM的关系也受到极大关注。在临床实践中，DM 患者的血糖控制不良会使患牙周炎的可能性增加，已有牙周炎的甚至能加快其进展速度[2-3]。DM 患者常同时存在较严重的牙周病，它会引起慢性炎症反应，可能对血糖控制产生不良影响[4]。长期慢性高血糖改变了血脑屏障的功能和结构，使血管通透性增加，神经毒性基质进入大脑，影响神经功能。有研究发现，神经元细胞变性、凋亡导致的神经元数目减少是造成认知功能障碍的病理基础[5]。细胞凋亡不仅影响正常发育中的神经系统，在各种急慢性神经退行性疾病的病程进展中也起重要作用。而在牙周病人牙龈组织破坏的炎症进程中，凋亡相关因子的表达量有所增加[6-7]。因此，如何有效控制DM和牙周炎的进程，进而控制血糖，预防脑并发症的发生或改善其病理进展是尚待解决的重要难题。

青蒿琥酯（artesunate，ART）为青蒿素的衍生物，有抑制炎症因子形成的功效[8]。此外，ART还有抗肿瘤的作用，并且由于其良好的耐受性，ART 常用于与其他药物进行的混合配置[9-10]。作为治疗脑型疟疾最有效的药物，近期的研究发现，ART 在治疗脑型疟疾的过程中还能缓解脑的炎症状态[11-12]。ART 能够透过血脑屏障到达脑内并且维持较高的浓度，这个特性使它能够成为一种治疗中枢神经系统疾病及神经功能紊乱的备选药物[13]。有研究团队对外伤性脑损伤进行研究时发现ART 具有抗凋亡作用，从而证实ART具有一定的保护神经细胞的作用[14]。同时ART 对1 型DM 还具有一定的预防作用[15]。因此，本实验构建了1型DM和牙周病大鼠模型，并以不同浓度的ART进行药物干预。处死大鼠取材后通过苏木精－伊红（HE）染色来观察脑组织病理改变，使用免疫组化染色分析脑组织相应部位肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白的表达情况，探究ART不同的干预浓度对脑组织病变的影响，为临床中口腔－全身疾病的预防及治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药物 选择SPF级SD大鼠，雄性，6 周龄，约200 g，购于广西医科大学实验动物中心。大鼠在SPF 级实验室中使用亚笼饲养，在20～25 ℃的环境温度下自由进食和饮水。链脲佐菌素（STZ）与戊巴比妥钠购于美国sigma 公司，ART 购买于桂林南药股份有限公司（国药准字H10930195）。

1.2 实验分组 试验性喂养1周后，将48只大鼠随机分为6组，即对照组、1 型DM组（DM）、伴牙周病1 型DM组（DM&PD）、ART低剂量干预组（DM&PD ART 10 mg/kg）、ART中剂量干预组（DM&PD ART 30 mg/kg）、ART高剂量干预组（DM&PD ART 60 mg/kg），每组8只。确认成模后，各干预组每日分别予ART 10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg灌胃治疗，持续4周。

1.3 构建模型 大鼠腹腔注射1%STZ(60 mg/kg)构建1 型DM 模型。注射后第3、第7、第14 天尾尖采血测空腹血糖值，若均高于16.7 mmol/L，则确认建模成功。使用正畸结扎丝结扎上颌磨牙颈部，同时在龈沟内涂布牙龈卟啉单胞菌菌液来构建牙周病模型。之后观察牙周情况，若出现牙龈出血红肿、牙槽骨吸收、附着丧失等相关牙周病病征即可确认牙周病造模成功。

1.4 终末血糖测定 用药4周后，尾尖针刺后用罗氏试纸采血，使用快速血糖仪（罗氏活力型，德国）测大鼠空腹血糖值。之后使用过量戊巴比妥钠溶液麻醉处死大鼠。

1.5 制作石蜡切片组织固定液（4%多聚甲醛）固定大鼠脑组织，24 h 后，沿矢状面切成厚度约2 mm的薄片，采用二甲苯以及75%、85%、95%、无水酒精进行梯度脱水，浸蜡后在包埋机上进行包埋。包埋好的蜡块-20 ℃冷冻2 h 后在切片机上进行连续切片。恒温箱中60 ℃烤片4 h后装盒备用。

1.6 HE染色观察脑组织病理学改变（1）脱蜡、复水：将切片放入二甲苯、二甲苯、二甲苯、无水乙醇、95%酒精、85%酒精、75%酒精各5 min，蒸馏水洗3 次。（2）苏木精染细胞核：将切片放入新配的苏木精染液中1 min，挂缸30 s，蒸馏水洗3次，1%盐酸酒精分化10 s，蒸馏水洗3次，返蓝10 min，显微镜下观察细胞核均蓝染着色后，行下一步。（3）伊红染细胞质：将切片置入伊红染液中5 s，后蒸馏水洗3 次。（4）脱水封片：将染好后的切片置烤片机上充分烤干，中性树胶封片。（5）显微镜观察，采集图像并分析。

1.7 免疫组化染色观察TNF-ɑ、Caspase-3表达情况 取切片按上述脱蜡复水步骤操作后，用枸橼酸溶液（pH=6.0）浸没，置于高压锅内高压修复5 min，取出后自然冷却至室温，去离子水洗3次。后用3%过氧化氢溶液浸泡10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗3 次。后将切片在山羊血清中封闭10 min，甩去血清后加一抗TNF-α、Caspase-3（稀释倍数1∶250）置于4 ℃冰箱过夜。第二天取出切片回复至室温，PBS 洗3 次后滴加二抗并37 ℃孵育10 min。PBS 洗3 次后滴加辣根素（SAB）置于37 ℃孵育10 min。PBS 洗3 次后滴加DAB 显色液，约3 min 流水轻柔冲洗，苏木精复染，显微镜下观察到细胞核着色后用1%盐酸酒精分化10 s，染色即完成。按上述步骤干燥并封片。之后使用Nikon正置荧光显微镜拍摄脑组织切片相应阳性表达区域。400 倍率观察并采集图像。采用Image pro plus6.0软件分析计算图像中相应部位TNFɑ、Caspase-3 蛋白阳性表达的平均光密度值(mean optical density,MOD)。

1.8 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠的终末血糖值比较 与对照组比较，DM组与DM&PD组大鼠的终末血糖值显著较高，且DM&PD组升高更明显（P＜0.01）。各干预组血糖值有不同程度的下降（P＜0.01），其中DM&PD ART 60 mg/kg组下降较为明显，DM&PD ART 10 mg/kg组、DM&PD ART 30 mg/kg组较为接近，见图1。

2.2 脑组织HE染色结果 在对照组大鼠脑组织皮层运动区中，神经元结构较完整，细胞膜、细胞质、细胞核结构清晰，层次清楚。DM组大鼠皮层出现核固缩和核深染的神经元数量明显增加，DM&PD组更明显。3个不同ART浓度的治疗组神经元细胞结构和形态均有不同程度的改善，神经元核固缩和核深染的数量明显降低（图2a）。不同组别核固缩和核深染的神经元的占比（异常神经元细胞数量/视野下的总细胞数量）结果（图2b）。DM组与DM&PD组异常神经元占比明显高于对照组（P＜0.01），DM组比DM&PD组低（P＜0.05）。各ART干预组异常神经元占比明显低于DM&PD组（P＜0.01），ART 30 mg/kg组和ART 60 mg/kg组低于ART 10 mg/kg组（P＜0.01），说明ART 干预可能减轻神经元退行性变，且与浓度有关。

2.3 脑组织TNF-α，Caspase-3免疫组化染色结果

各组大鼠脑组织皮层运动区神经细胞细胞质和胞膜中均见有TNF-α、Caspase-3的棕黄色颗粒表达（图2a）。各组间相互比较可发现（图2c,2d），DM组及DM&PD组TNF-α、Caspase-3 的表达明显要高于对照组，且DM&PD组TNF-α、Caspase-3 的表达高于DM组（均P＜0.01）。不同ART 剂量的干预组TNF-α、Caspase-3 的表达明显低于DM&PD组。TNF-α 的表达量 在DM&PD ART 10 mg/kg组 与DM&PD ART 30 mg/kg组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）,而DM&PD ART 60 mg/kg组的表达量明显低于DM&PD ART 10 mg/kg组与DM&PD ART 30 mg/kg组（P＜0.01）。Caspase-3的表达量在DM&PD ART 10 mg/kg组与DM&PD ART 30 mg/kg组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而DM&PD ART 60 mg/kg组的表达量明显低于DM&PD ART 10 mg/kg组与DM&PD ART 30 mg/kg组（P＜0.01）。

图1 各组大鼠终末血糖值比较

3 讨论

在牙周病的影响下，DM 引起的脑组织病变会朝更严重的方向发展，这是一个多因素互相影响的过程，最终常常导致患者认知功能弱化，严重的甚至生活难以自理。因此，对于伴牙周病的DM 脑组织病变相关机制的研究有重要的意义。本研究通过注射STZ 并对大鼠磨牙区进行结扎涂菌来构建伴牙周病I型DM模型，参考了国内外学者的常用方法[16-17]。成模效果良好，模型组的大鼠可见明显的DM及牙周炎症表现，可见其多饮多食多尿，体重反而下降，伴有牙龈出血、牙周附着丧失、牙周溢脓、牙槽骨有一定程度的吸收。课题组前期实验已尝试使用50 mg/kg ART 和100 mg/kg ART 灌胃干预，发现100 mg/kg ART干预降糖效果较好，但与50mg/kg ART相比并无太大差别。同时还发现，过高浓度的ART干预对大鼠的肝肾代谢有一定毒副作用，故尝试本实验中所采用的3种ART干预浓度来探究较为合理的剂量。

通过HE 染色的结果可以发现，对照组大鼠大脑皮层中的神经元结构完整，排列紧密，层次清楚。DM组大鼠皮层出现核固缩和核深染的神经元数量明显增加，且细胞间隙增大，数量减少，体积缩小。这在DM&PD组更为明显。而在3个不同ART浓度的治疗组中可观察到神经元细胞结构和形态有不同程度的改善。为了进一步研究，笔者对大鼠大脑皮层中的TNF-ɑ、Caspase-3 表达量进行了分析。

在牙周病及DM 进展的过程中，TNF-ɑ 是一个重要的起促炎作用的因子。TNF-α是一种从具有免疫活性的细胞释放的具有促炎作用的可溶性递质。它能促进前列腺素合成，促进肿瘤生长，激活破骨细胞功能，促进骨吸收。TNF-α 的各项作用表明它在介导由感染或其他损害导致的免疫炎症反应的过程中扮演重要的角色[18]。在牙周病患者中能检测到高浓度的TNF-α，说明其对牙周病程的进展有重要作用。同时，又有研究报道，DM患者增长的TNF-α激活了各种应激酶，使胰岛素底物受体（IRS-1）磷酸化，进而扰乱胰岛素信号传导[19-21]。胰岛素信号通路对于神经细胞行使正常的功能有重要的作用，因而炎症介导的信号通路的改变会导致神经细胞功能的缺陷[22-24]。

研究证实，DM患者若伴有牙周病，他们的血糖会更难控制[25-27]。在本实验中，从脑组织皮层中测得的TNF-ɑ 表达量可以发现，DM&PD组明显高于DM组（P＜0.01），可见牙周病确实在一定程度上加大了DM引起的脑组织炎症的严重程度。3个治疗组ART的浓度逐渐提高，TNF-ɑ的表达量逐渐降低（P＜0.01），说明ART 可能缓解了脑组织的炎症状态，且浓度越高效果越好。

近年来，关于DM 引起的脑并发症的研究较热门，许多学者将DM与阿尔茨海默病（AD）联系在一起，将其列为AD的独立危险因素。最近对AD病程的研究发现，在细胞凋亡过程中，Caspase-3 裂解了细胞中的早老素（与早期发病的家族性AD 有关）。基于此，一种假说认为Caspase-3介导的相关蛋白的裂解可能促进神经退行性疾病的发生并最终导致神经元非正常的凋亡[28]。有实验提出，这一行为可能促进Aβ蛋白的病理性增长，诱发细胞凋亡，使神经元发生退行性变化，最终导致认知障碍的发生[29-31]，但具体机制仍待探究。本实验通过免疫组化确实能观察到Caspase-3 在DM&PD组的表达量明显高于DM组（P＜0.01），当ART干预的浓度较高时，Caspase-3 的表达量更低（P＜0.01）。说明ART也许通过控制Caspase-3 的表达来缓解脑组织神经细胞的凋亡进程，从而起到保护神经细胞的作用。

综上所述，本研究通过构建1 型DM 和牙周病模型，探究了伴牙周病1 型DM 大鼠脑组织炎症相关机制及神经细胞凋亡水平，并采用不同浓度的ATR 进行干预，发现其能有效降低脑组织炎症反应，保护神经细胞，减少其凋亡。分析得出较高浓度的ART对伴牙周病1型DM引起的脑组织病变有一定的防治作用。本课题组近期研究发现，伴DM牙周炎大鼠肠道上皮有所损伤，通透性改变，会造成肠道菌群组成变化。相关研究发现，脑－肠－菌群间存在相互作用，肠道菌群改变会影响脑稳态，使得患者进食的回馈机制和抑制机制出现问题，可能进一步加重DM进展。之后的研究可朝此方向深度探究。同时，本研究对于炎症和凋亡相关通路的探索比较局限，尚待进一步的深入探究。