Hp 阳性胃癌组织miR-1290、miR-490-3p表达变化及其临床意义

杨宁波，寇耀，贾映东

遂宁市中心医院，四川遂宁629000

2018 年全球胃癌新发病例约103.4 万例，死亡约78.3 万例，其发病率和死亡率分别居所有恶性肿瘤的第5、3 位［1］。胃癌的发生是遗传因素、环境因素、幽门螺旋杆菌（Hp）感染等诸多因素长期综合作用的结果，其中Hp 感染被世界卫生组织明确列为胃癌的Ⅰ类致癌因素［2］。Hp 感染在胃炎、胃溃疡、胃癌前病变和胃癌等胃部疾病的演变过程中均具有重要作用［3］。因此，探究Hp 阳性胃癌发生、发展的分子机制并从中寻找肿瘤标志物，对Hp 阳性胃癌的诊断、治疗和预后判断具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一类长度为20～24 nt 的小RNA分子，在机体内广泛分布，通过与靶mRNA 特异性结合而调控基因的表达，从而参与机体生长、发育等生物学过程［4］。在胃癌的发生、发展过程中存在众多miRNA 异常表达，这些异常表达的miRNA 可能参与胃癌细胞的增殖、迁移和耐药性等［5］。微小RNA-1290（miR-1290）在胰腺癌和食管鳞癌等消化系统肿瘤中表达上调，可参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等多种生物学过程［6-7］。微小RNA-490-3p（miR-490-3p）在多种肿瘤中表达下调，能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学过程［8］。但目前关于Hp 阳性胃癌组织miR-1290、miR-490-3p 表达的研究较少。为此，我们进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014 年1 月—2015 年6 月遂宁市中心医院收治的胃癌患者92 例。纳入标准：①经术后组织病理学检查明确胃癌诊断；②初诊；③接受外科手术治疗；④临床相关资料和术后随访资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②合并自身免疫性疾病或全身急慢性感染者；③心、肝、肾等重要脏器功能障碍者。根据Warthin-Starry染色结果，将胃癌患者分为Hp 阳性61 例、Hp 阴性31 例。Hp 阳性胃癌患者中，男39 例、女22 例，年龄34～65（49.46 ± 6.08）岁；肿瘤直径：≤3 cm 31 例，＞3 cm 30例；病理类型：腺癌48例，印戒细胞癌10例，黏液癌3 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期41 例，Ⅲ、Ⅳ期20例；组织分化程度：低分化24 例，高中分化37 例；浸润深度：黏膜层25例，黏膜下层36例；有淋巴结转移30 例，无淋巴结转移31 例；有远处转移27 例，无远处转移34 例。Hp 阴性胃癌患者中，男22 例、女9例，年龄32～67（49.69±5.78）岁；肿瘤直径：≤3 cm 16 例，＞3 cm 15 例；病理类型：腺癌25 例，印戒细胞癌5例，黏液癌1例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期21例，Ⅲ、Ⅳ期10 例；组织分化程度：低分化14 例，高中分化17例；浸润深度：黏膜层13 例，黏膜下层18 例；有淋巴结转移16 例，无淋巴结转移15 例；有远处转移14例，无远处转移17 例。Hp 阳性与阴性胃癌患者临床资料具有可比性。本研究经遂宁市中心医院医学伦理委员会审核，患者或其家属知情同意。

1.2 miR-1290、miR-490-3p 表达检测 采用RTqPCR 法。取手术切除的胃癌组织及其配对的癌旁组织（距肿瘤组织边缘＞5 cm，并经组织病理学检查证实为正常胃组织），剪碎后置于液氮预冷的研钵，在液氮下用研杵研磨成粉末，然后转移至1.5 mL 离心管中。采用TRIzol 法提取和分离组织总RNA。根据cDNA合成试剂盒操作说明将总RNA逆转录为cDNA。逆转录反应条件：37 ℃20 min，80 ℃1 min。按实时荧光定量PCR 试剂盒操作说明行PCR 扩增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。 引物序列：miR-1290 上游引物5"-GCAAAGTGTGTTCTTAAGCG-3"、下游引物5"-TGC⁃GATGCTAGCGTGACC-3"，miR-490-3p 上游引物5"-AAGGGTAGATTTAGGCTGTA-3"、下 游 引 物 5"-AGTTGAGAAAAAGTTATGCAC-3"，内参U6 上游引物5"-CCCTATTTTTGACGCGTTATGTGA-3"、下游引物3"-GTGAAAATTACAGGGTCATTTGTG-5"。按PCR试剂盒说明配制反应体系。PCR 反应条件：94 ℃5 min，94 ℃30 s、60 ℃50 s、70 ℃10 s 共40 个循环。检测仪器为CFX 384Touch多通道荧光定量PCR 仪，所有检测由专人负责并严格按照试剂盒说明书和仪器操作规程进行操作。以U6 为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。

1.3 随访 采用门诊复查形式定期随访，随访截至2020 年6 月30 日。以患者死亡或至随访截至日期为终点，统计患者5年总生存率。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比较采用Log-rank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁正常组织miR-1290、miR-490-3p表达比较 见表1。

表1 胃癌组织与癌旁正常组织miR-1290、miR-490-3p相对表达量比较（ ± s）

表1 胃癌组织与癌旁正常组织miR-1290、miR-490-3p相对表达量比较（ ± s）

注：与癌旁正常组织Hp同状态比较，*P＜0.05；与同组织类型Hp阴性比较，#P＜0.05。

组织类型癌旁正常组织Hp阴性Hp阳性胃癌组织Hp阴性Hp阳性n miR-1290 miR-490-3p 31 61 10.07±1.85 9.84±1.79 34.59±8.07 33.74±7.95 15.72±3.28*10.96±2.08*#31 61 20.54±4.38*29.58±5.01*#

2.2 胃癌组织miR-1290 表达与miR-490-3p 表达的关系 无论是Hp 阳性胃癌组织还是Hp 阴性胃癌组织，miR-1290 表达与miR-490-3p 表达均无明显相关性（r分别为-0.178、-0.079，P均＞0.05）。

2.3 Hp 阳性胃癌组织miR-1290、miR-490-3p 表达与患者临床病理特征的关系 见表2。

2.4 Hp 阳性胃癌组织miR-1290、miR-490-3p 表达与患者预后的关系 分别以Hp 阳性胃癌组织miR-1290、miR-490-3p 相对表达量的中位数（28.71、10.12）为临界值，将患者分为miR-1290 低表达者30 例与miR-1290 高表达者31 例、miR-490-3p 低表达者30 例与miR-490-3p 高表达者31 例。结果发现，miR-1290 低表达者5 年总生存率为56.7%（17/30），miR-1290 高表达者为22.6%（7/31），miR-1290 低表达者5 年总生存率明显高于miR-1290 高表达者（χ2=5.057，P＜0.05）；miR-490-3p 低表达者5年总生存率为20.0%（6/30），miR-490-3p 高表达者为58.1%（18/31），miR-490-3p 低表达者5 年总生存率明显低于miR-490-3p 高表达者（χ2=6.658，P＜0.05）。见图1、2。

3 讨论

据报道，我国每年胃癌新发病例约42 万例，死亡约30 万例，已成为全球胃癌高负担国家之一［9］。由于胃癌早期症状隐匿，多数患者就诊时已属中晚期，即使经积极综合治疗，远期预后仍然不佳，5 年生存率仅27%。目前，Hp 感染是胃癌最明确、最重要的致病因素，但其导致胃癌发病的分子机制尚不完全清楚。因此，深入研究Hp感染所致胃癌的分子机制，对探索胃癌早期诊断的分子标志物和治疗靶点具有重要意义。

miRNA 是一类小分子单链非编码RNA，能在转录后水平调控靶基因的表达。miRNA 与mRNA 结合形成双链RNA 并被Dicer 蛋白识别，Dicer 蛋白具有核糖核酸酶活性，能够催化双链RNA 断裂而造成mRNA 降解，从而下调基因的表达。有研究报道，肿瘤、炎症性或免疫性疾病存在多种miRNA 异常表达现象［10］。JIANG 等［11］报道，Hp 感染会引起胃黏膜组织中一系列miRNA 的异常表达，并且这部分异常表达的miRNA 能够影响胃黏膜组织中促癌基因或抑癌基因的异常表达，从而导致胃癌的发生、发展。miR-1290是近年发现的具有肿瘤促进作用的miRNA，其在宫颈癌、口腔鳞癌等恶性肿瘤组织中表达升高，体外研究证实miR-1290 过表达能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移［12］。因此，miR-1290 有可能成为胃癌诊断的潜在分子标志物。在肿瘤中还存在一些具有肿瘤抑制作用的miRNA，如miR-26a，其能抑制c-Myc等癌基因表达，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学行为［13］。近年有学者报道，miR-490-3p作为一种新的抑癌基因，能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学行为，并且还能诱导肿瘤细胞凋亡［14］。但目前关于Hp 阳性胃癌组织miR-1290、miR-490-3p表达的研究报道较少。

本研究结果发现，Hp 阳性胃癌组织miR-1290表达上调，并且有远处转移、淋巴结转移以及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期患者miR-1290 表达明显升高，提示miR-1290 表达上调能够促进Hp 阳性胃癌的发生、发展。细胞周期蛋白G2具有肿瘤抑制作用，其通过阻滞细胞周期进展而抑制肿瘤细胞增殖。有研究报道，miR-1290 通过抑制细胞周期蛋白G2 表达，导致肿瘤恶性进展［15］。因此，Hp阳性胃癌组织miR-1290表达上调可能会下调细胞周期蛋白G2转录水平，导致其表达下调，最终解除细胞周期蛋白G2 对Hp 阳性胃癌细胞的增殖抑制作用，从而促进肿瘤细胞增殖。有研究发现，miR-1290 可通过抑制碱性螺旋—环—螺旋转录因子表达来下调上皮标志物表达，导致肿瘤恶性程度增加［16］。提示miR-1290 表达失调可能通过引起上皮间质转化而促进肿瘤侵袭和转移。目前，miR-1290 在Hp 阳性胃癌中表达上调的分子机制以及Hp 感染在miR-1290 表达上调中的作用尚不清楚，仍需进一步研究。

表2 Hp阳性胃癌组织miR-1290、miR-490-3p表达与患者临床病理特征的的关系

图1 Hp阳性胃癌患者不同miR-1290表达者的生存曲线

图2 Hp阳性胃癌患者不同miR-490-3p表达者的生存曲线

本研究结果发现，Hp 阳性胃癌组织miR-490-3p表达下调，提示其表达下调可能与胃癌的发生、发展有关。但miR-490-3p 表达下调导致胃癌发生、发展的分子机制尚不清楚，可能与长链非编码RNA（如lncRNA RP11-480112.5）表达调控的抑制作用有关［17］。本研究还发现，有远处转移、淋巴结转移以及TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期Hp 阳性胃癌患者miR-490-3p 表达明显下降，表明miR-490-3p 在Hp 阳性胃癌侵袭和转移的分子调节过程中发挥重要作用。有研究报道，促癌基因高迁移率族蛋白A2是miR-490-3p的靶基因，miR-490-3p 能够下调高迁移率族蛋白A2 表达，抑制细胞上皮间质转化，从而延缓肿瘤恶性进展［18］。

本研究生存分析发现，miR-1290 低表达者5 年总生存率明显高于miR-1290 高表达者，miR-490-3p低表达者5年总生存率明显低于miR-490-3p高表达者，提示miR-1290 高表达、miR-490-3p 低表达与Hp阳性胃癌患者预后不良密切相关，二者有可能作为Hp阳性胃癌患者预后评估的分子标志物。

综上所述，Hp 阳性胃癌组织miR-1290 表达上调、miR-490-3p表达下调，其表达变化与肿瘤淋巴结转移、远处转移、TNM 分期和患者预后有关。miR-1290、miR-490-3p有可能成为Hp阳性胃癌诊断和预后评估的分子标志物。