血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平对结肠癌腹腔镜术后复发转移的预测价值

张刘平，许政文，张兴，何跃

遂宁市中心医院，四川遂宁629000

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内其发病率和病死率均居恶性肿瘤前列。近年随着社会经济飞速发展，人民生活方式转变，结肠癌的发病率不断上升［1］。外科手术仍然是当前结肠癌最重要的治疗手段，但术后面临较高的复发转移风险［2］。目前，临床对结肠癌术后复发转移评估主要依据临床随访或影像学证据，缺少评估术后复发转移的生物标志物。微小RNA（miRNA）是一类拥有基因调控功能的RNA，是转录后调控网络的核心调控因子，能够调控细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程［3］。miR-335-5p是miRNA家族成员之一。有研究报道，miR-335-5p在胰腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤细胞中表达下调，其表达下调能够抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移［4-5］。癌胚抗原（CEA）和糖类抗原19-9（CA19-9）是临床常用的肿瘤诊断生物标志物，在多种恶性肿瘤中表达上调，但对诊断结肠癌的特异性不强［6-8］。本研究观察了结肠癌患者血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平变化，并探讨三者对结肠癌腹腔镜术后复发转移的预测价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017 年5 月—2019 年5 月遂宁市中心医院收治的结肠癌患者89 例（观察组）。所有患者经术后组织病理学检查明确诊断。纳入标准：①符合结肠癌诊断标准；②首次诊断；③接受腹腔镜手术，术前未接受任何抗肿瘤治疗；④临床病理资料和随访资料完整。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②合并心、肝、肾等重要脏器功能不全者；③发生远处转移者；④预计生存期不足3 个月者。其中，男48 例、女41 例，年龄53～69（62.03 ±4.82）岁；肿瘤直径：≥3 cm 46 例，＜3 cm 43 例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期38 例，Ⅲ、Ⅳ期51 例；浸润深度：未侵及浆膜层43例，侵及浆膜层46例；组织分化程度：低中分化53例，高分化36例。同期选择遂宁市中心医院收治的结肠良性病变患者61例（对照组），均接受腹腔镜手术切除病变组织，并经术后组织病理学检查排除恶性肿瘤。同时，排除合并其他部位恶性肿瘤者，合并心、肝、肾等重要脏器功能不全者，合并急慢性感染、免疫性疾病、精神障碍性疾病者。其中，男39 例、女22 例，年龄51～70（62.09 ± 4.17）岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经遂宁市中心医院医学伦理委员会批准，所有研究对象或其家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 血清miR-335-5p 检测 采集所有研究对象术前外周静脉血3 mL，注入干燥的试管内，室温静置30 min，3 000 r/min 离心10 min、离心半径10 cm，留取上层血清，-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol法提取血清中的总RNA，经紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0。按照M-MLV逆转录酶试剂盒说明，将总RNA 逆转录为cDNA，然后按PCR 扩增试剂盒说明进行扩增。所有引物序列由上海基康生物技术有限公司设计合成。miR-335-5p 上游引物5"-ACGCT⁃CAGTTTAATGCTAATCGTGA-3"，下游引物5"-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTGTG-3"；U6 上游引物5"-AGAGAAGATTAGCATGGACCCTG-3"，下游引物5"-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3"。PCR反应体系：2×SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ12.5 μL，dNTP 1.6 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，上下游引物各1 μL，DEPC 水补足至25 μL；反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s 共40 个循环。所有操作在CFX96 实时荧光定量PCR 仪上完成。以U6 为内参，采用2-ΔΔCT法计算miR-335-5p 相对表达量。

1.3 血清CEA、CA19-9 检测 采集所有研究对象术前外周静脉血3 mL，注入干燥的试管内，室温静置30 min，3 000 r/min 离心10 min、离心半径10 cm，留取上层血清，-80 ℃冰箱保存。采用COBAS 6000电化学发光全自动免疫分析仪检测血清CEA、CA19-9，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。所有操作严格按试剂盒说明进行。

1.4 随访 结肠癌患者腹腔镜术后定期行肠镜、腹部CT 或B 超、胸部X 线等检查，每6 个月一次，评估结肠癌复发转移情况。结肠癌复发转移标准：结肠癌术后出现新的结肠癌病灶或出现盆腔转移灶，伴或不伴远处转移病灶。随访截至2020 年5 月，以出现结肠癌复发转移为终点事件。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料以±s表示，结果比较采用独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier 法。危险因素分析采用Cox 回归模型。采用受试者工作特征（ROC）曲线评估血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平对结肠癌腹腔镜术后复发转移的预测价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平比较 见表1。

表1 两组血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平比较（±s）

表1 两组血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别观察组对照组CA19-9（kU/L）38.49±6.59*26.16±5.13 n 89 61 miR-335-5p 0.91±0.33*2.25±0.69 CEA（ng/mL）6.53±2.06*2.95±0.71

2.2 血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平与结肠癌腹腔镜术后复发转移的关系 结肠癌患者腹腔镜术后随访12～36 个月、中位随访时间19 个月，无失访病例。截至末次随访，89 例结肠癌患者腹腔镜术后复发转移40 例。分别以血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平的均数为临界值，将患者分为miR-335-5p低水平者46 例与miR-335-5p 高水平者43 例、CEA低水平者40 例与CEA 高水平者49 例、CA19-9 低水平者42 例与CA19-9 高水平者47 例。miR-335-5p、CEA、CA19-9 低水平者腹腔镜术后复发转移率分别为58.70%（27/46）、30.00%（12/40）、30.95%（13/42），miR-335-5p、CEA、CA19-9 高水平者分别为30.23%（13/43）、57.14%（28/49）、57.45%（27/47）。miR-335-5p 低水平者腹腔镜术后复发转移率高于miR-335-5p 高水平者，而CEA、CA19-9 低水平者腹腔镜术后复发转移率低于CEA、CA19-9 高水平者（χ2分别为8.618、6.521、6.100，P均＜0.05）。

2.3 影响结肠癌腹腔镜术后复发转移的危险因素分析 影响结肠癌腹腔镜术后复发转移的单因素分析结果见表2。以结肠癌腹腔镜术后复发转移（0=否，1=是）为因变量，以TNM分期（0=Ⅰ、Ⅱ期，1=Ⅲ、Ⅳ期）、浸润深度（0=未侵及浆膜层，1=侵及浆膜层）、组织分化程度（0=高分化，1=低中分化）、miR-335-5p（连续变量）、CEA（连续变量）、CA19-9（连续变量）为自变量，纳入Cox 回归模型，结果显示，TNM分期、miR-335-5p、CEA、CA19-9 是影响结肠癌腹腔镜术后复发转移的危险因素（P均＜0.05）。见表3。

表2 影响结肠癌腹腔镜术后复发转移的单因素分析结果

2.4 血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平对结肠癌腹腔镜术后复发转移的预测价值 绘制血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平单独和联合预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的ROC 曲线，结果发现，血清miR-335-5p水平预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的曲线下面积（AUC）为0.876（95%CI：0.799～0.953），其cut off 值为1.03，此时其预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的灵敏度为82.50%、特异度为79.59%；血清CEA 水平预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的AUC为0.797（95%CI：0.706～0.898），其cut off 值为5.32 ng/mL，此时其预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的灵敏度为77.50%、特异度为71.43%；血清CA19-9 水平预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的AUC为0.722（95%CI：0.614～0.831），其cut off 值为30.18 kU/L，此时其预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的灵敏度为67.50%、特异度为63.27%；血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平联合预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的AUC为0.959（95%CI：0.915～1.000），其预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的灵敏度为95.00%、特异度为97.96%。血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平联合预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的AUC明显高于血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水 平 单 独（Z分 别 为2.014、2.435、2.768，P均＜0.05）。见图1。

表3 影响结肠癌腹腔镜术后复发转移的Cox回归分析结果

图1 血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的ROC曲线

3 讨论

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，具有高度侵袭性和转移性，是全世界恶性肿瘤死亡的主要原因。结肠癌早期无典型症状，大多数患者确诊时已处于中晚期，错过了根治性手术的最佳时机［9］。外科手术是结肠癌最主要的治疗手段，但术后面临较高的复发转移风险［2］。目前，临床对结肠癌术后复发转移评估主要依据临床随访或影像学证据，缺少评估术后复发转移的生物标志物。因此，探索结肠癌术后复发转移相关的生物标志物对准确判断患者预后具有重要意义。

CEA 是首先从结肠癌和胚胎组织中提取的一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，存在于内胚层细胞分化而来的癌细胞表面。结直肠癌、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤患者血清CEA 水平明显升高，可作为一种广谱肿瘤标志物，用于恶性肿瘤的诊断、鉴别诊断、病情监测或疗效评估等。CA19-9 是一种低聚糖类肿瘤相关的糖类抗原，由胰腺、胆管、胃、结肠、子宫内膜等组织合成，正常情况下血清中的含量很少，但在良恶性肿瘤患者血清中的含量明显升高，可作为肿瘤诊断和鉴别诊断的生物标志物。虽然CEA、CA19-9被推荐为结直肠癌预后评估的生物标志物，但二者的特异度不强［7-8］。miR-335-5p 是miRNA家族成员之一，其表达失调与多种恶性肿瘤的发生、发展有关。AN等［10］研究认为，miR-335-5p可通过抑制下游癌基因十字形结构域蛋白2C表达，从而抑制胰腺癌进展。LIU 等［11］研究发现，上调miR-335-5p表达可抑制重组人BCL2样2蛋白表达，增强卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性。DU等［12］研究报道，miR-335-5p 可与Rho 相关的卷曲蛋白激酶1（ROCK1）3′端非编码区直接结合，进而抑制ROCK1 表达，阻止转化生长因子β1介导的肺癌细胞侵袭和迁移。此外，miR-335-5p 还可靶向B7 同源体3（B7-H3）抑制肿瘤细胞侵袭和迁移［13］，而miR-335-5p 表达缺失可上调B7-H3表达，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，从而引起肿瘤术后复发和转移［14］。miR-335-5p表达受竞争性内源性分化拮抗非蛋白编码RNA（DAN⁃CR）调控，DANCR 能够通过竞争性结合miR-335-5p而调控ROCK1表达，从而促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化等［15-17］。

本研究结果发现，观察组血清miR-335-5p 水平低于对照组，而血清CEA、CA19-9 水平高于对照组；以血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平的均数为临界值，将患者分为miR-335-5p、CEA、CA19-9 低水平者与高水平者，结果发现miR-335-5p 低水平者腹腔镜术后复发转移率高于miR-335-5p 高水平者，而CEA、CA19-9 低水平者腹腔镜术后复发转移率低于CEA、CA19-9 高水平者。提示血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平可能与结肠癌腹腔镜术后复发转移有关。本研究单因素分析发现，结肠癌腹腔镜术后复发转移可能还与TNM 分期、浸润深度和组织分化程度有关；Cox 回归分析发现，TNM 分期、miR-335-5p、CEA、CA19-9是影响结肠癌腹腔镜术后复发转移的危险因素。进一步表明血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平均与结肠癌腹腔镜术后复发转移有关。本研究ROC曲线分析显示，血清CEA、CA19-9水平预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的AUC 分别为0.797、0.722，其预测灵敏度分别为77.50%、67.50%，特异度分别为71.43%、63.27%，证实血清CEA、CA19-9 水平对结肠癌腹腔镜术后复发转移均具有一定预测价值，但二者的灵敏度和特异度不理想；miR-335-5p 预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的AUC 为0.876，其预测灵敏度为82.50%、特异度为79.59%，说明miR-335-5p可作为预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的生物标志物；血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平联合预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的AUC 为0.959，其预测灵敏度为95.00%、特异度为97.96%。三者联合预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的效能明显高于三者单独，提示多种生物标志物联合对结肠癌腹腔镜术后复发转移的预测价值更高。

综上所述，结肠癌患者血清miR-335-5p 水平降低，而血清CEA、CA19-9 水平升高，三者水平变化与结肠癌腹腔镜术后复发转移有关。miR-335-5p、CEA、CA19-9 可作为预测结肠癌腹腔镜术后复发转移的血清生物学指标。