外周血ERβ 基因AluI 位点多态性与妊娠期糖尿病易感性的关系

钟萍，莫蕾，全丽虹

桂林医学院第二附属医院，广西桂林541199

妊娠期糖尿病（GDM）是妊娠期特有的代谢性疾病，可增加妊娠期高血压、子痫前期、新生儿窒息等母婴并发症的发生风险［1］。一般认为，GDM 的发病机制与炎症反应、免疫反应、代谢紊乱、胰岛素抵抗等有关。近年研究发现，一些重要基因的突变可能亦与GDM 的发生有关［2］。雌激素受体（ER）是一类由配体激活的核转录因子。在妊娠期ER 主要发挥抗孕激素、调节脂质代谢、促进葡萄糖摄取等作用，故ER 表达异常可能与GDM 的发生有关［3］。ER有ERα、ERβ 两种亚型，其中ERα 基因多态性已被证实与GDM 的发生有关［4］，而ERβ 基因多态性与GDM 的易感性是否相关尚不明确。为此，本研究观察了外周血ERβ 基因AluI 位点多态性与GDM 易感性的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018 年1 月—2020 年3 月桂林医学院第二附属医院接诊的GDM 孕妇500 例（观察组）。所有患者符合《妊娠合并糖尿病诊治指南（2014）》中的诊断标准［5］。纳入标准：①符合GDM诊断标准；②初诊；③单活胎妊娠，孕周＞24 周；④年龄20～40 岁，汉族。排除标准：①经辅助生殖技术受孕者；②孕前3个月内有激素暴露史者；③妊娠期吸烟或酗酒者；④孕前合并糖尿病、高血压、心脏病、高脂血症等疾病者；⑤合并心、肝、肺、肾等重要脏器严重功能不全者；⑥合并血液系统或免疫系统疾病者。另选同期桂林医学院第二附属医院接诊的，与观察组年龄匹配的、糖耐量正常的单活胎妊娠孕妇500 例（对照组），均为汉族，入组前经产前检查排除妊娠期合并症或并发症。本研究经桂林医学院第二附属医院医学伦理委员会批准，所有研究对象或其家属知情同意。

1.2 外周血ERβ 基因AluI 位点多态性检测 所有研究对象妊娠24～28周采集空腹肘静脉血3 mL，置于肝素钠抗凝管中，然后加入红细胞裂解液轻轻吹打混匀，冰浴裂解30 min，4 ℃下2 000 r/min 离心3 min、离心半径8 cm，弃上清液，加入5%Chelez-100 200 μL 充分混匀，56 ℃孵育20 min，室温震荡10 s，4 ℃下3 000 r/min 离心2 min、离心半径10 cm，取上清液-20 ℃保存。取上清液60 μL，采用AU1001 全自动核酸提取仪及其配套试剂提取DNA，以Tris-HCl 为空白对照，采用UV7500 双光束紫外可见分光光度计鉴定提取的DNA 纯度和浓度，选 取OD260/OD280为1.6～1.8、浓 度＞50 ng/μL 的DNA 样本进行后续实验。通过GenBank 数据库查找ERβ 基因，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司设计合成。ERβ 基因AluI 位点上游引物5′-GACCTGCTGCTGGAGATGCT-3′下游引物5′-AATGAGCCACAGCA-3′；GAPDH 上游引物5′-TG⁃TACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物5′-CTG⁃GAAGGTGGACAGCGAGG-3′。以提取的DNA 为模板进行PCR 扩增。PCR 反应体系共20 μL：DNA 模板2 μL，上下游引物各0.6 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs 1.6 μL，Taq 酶1 μL，ddH2O 12.2 μL；反应条件：94 ℃5 min，94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s共35个循环，最后72 ℃5 min。取PCR 扩增产物10 μL，加入pFUW80 1 μg、B.M.10×H缓冲液2 μL、XhoI 1 μL、SpeI 1 μL，37 ℃消化3 h，65 ℃灭活10 min，2%琼脂糖凝胶电泳分离30 min，溴化乙锭染色，FR-250 电泳仪扫描成像。采用iMLDR 法SNaPshot 基因分型技术分析外周血ERβ基因AluI位点多态性。

1.3 血生化指标检测 所有研究对象妊娠24～28周采集空腹肘静脉血10 mL，4 ℃下3 000 r/min离心15 min、离心半径10 cm，取上层血清，-80 ℃保存。采用雅培i2000 全自动化学发光免疫分析仪及其配套试剂检测空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS），采用稳态模型法计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×FINS/22.5；采用罗氏Modular 全自动生化分析仪检测TC、TG。

1.4 资料收集与分析 收集所有研究对象年龄，孕前BMI、收缩压、舒张压和糖尿病家族史，妊娠24～28 周血生化指标（FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG），妊娠早期（末次月经至妊娠13周）和妊娠中期（妊娠14～28 周）体质量增加以及外周血ERβ 基因AluI位点多态性等临床相关资料，采用二元Logistic 回归模型分析影响GDM发生的危险因素。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Student-t检验；两样本均数比较采用独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。危险因素分析采用二元Logistic回归模型。群体代表性分析采用Hardy-Weinberg 遗传平衡检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血ERβ 基因AluI 位点基因型和等位基因分布比较 两组外周血ERβ 基因AluI 位点基因型和等位基因分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P均＞0.05），具有群体代表性。两组外周血ERβ 基因AluI 位点基因型和等位基因分布比较差异均有统计学意义（χ2分别为35.425、36.153，P均＜0.05），见表1。携带ERβ 基因AluI 位点AA、Aa基因型孕妇GDM 的发生风险明显高于携带aa 基因型孕妇（OR分别为1.726、1.439，95%CI分别为1.235～8.263、1.056～4.267），携带ERβ 基因AluI位点A 等位基因孕妇GDM 的发生风险明显高于携带a 等位基因孕妇（OR=1.821，95%CI：1.403～12.051）。

表1 两组外周血ERβ基因AluI位点基因型和等位基因分布

2.2 GDM 患者外周血ERβ基因AluI位点不同基因型者血生化指标比较 见表2。

表2 GDM患者外周血ERβ基因AluI位点不同基因型者血生化指标比较（±s）

表2 GDM患者外周血ERβ基因AluI位点不同基因型者血生化指标比较（±s）

注：与aa基因型者比较，*P＜0.05。

研究对象AA基因型者Aa基因型者aa基因型者TG（mmol/L）1.91±0.34 1.92±0.31 1.90±0.35 n 95 221 184 FPG（mmol/L）5.78±2.65*5.73±2.61*4.13±1.43 FINS（mmol/L）7.95±2.89*7.91±2.80*6.67±1.74 HOMA-IR 1.26±0.27*1.22±0.25*0.92±0.13 TC（mmol/L）4.49±0.51*4.42±0.47*3.65±0.36

2.3 影响GDM 发生的危险因素分析 单因素分析发现，观察组孕前BMI、孕前收缩压、糖尿病家族史、FPG、FINS、HOMA-IR、TC、妊娠早期体质量增加、妊娠中期体质量增加均高于对照组（P均＜0.05），而两组年龄、孕前舒张压、TG 比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表3。

表3 两组临床相关资料比较（±s）

表3 两组临床相关资料比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别观察组对照组n 500 500年龄（岁）29.35±5.12 28.91±5.42孕前BMI（kg/m2）24.35±4.15*21.05±3.02孕前收缩压（mmHg）123.15±6.09*120.43±5.03孕前舒张压（mmHg）65.32±4.12 64.83±4.08糖尿病家族史［例（%）］62（12.40）*26（ 5.20）FPG（mmol/L）5.15±2.35*3.62±0.51组别n观察组对照组FINS（mmol/L）7.46±2.61*7.52±1.06 TC（mmol/L）4.15±0.65*3.63±0.31 HOMA-IR 1.12±0.24*0.82±0.15 mmol/L（mmol/L）1.91±0.35 1.88±0.33 500 500体质量增加（kg）妊娠早期4.91±1.02*3.69±0.79妊娠中期10.53±3.95*7.35±2.81

以是否患GDM 为因变量（0=否，1=是），以孕前BMI（连续变量）、孕前收缩压（连续变量）、糖尿病家族史（1=无，2=有）、FPG（连续变量）、FINS（连续变量）、HOMA-IR（连续变量）、TC（连续变量）、妊娠早期体质量增加（连续变量）、妊娠中期体质量增加（连续变量）、ERβ 基因AluI 位点多态性（1=AA 基因型，2=Aa 基因型，3=aa 基因型）为自变量，纳入二元Logistic 回归模型。结果发现，FPG、糖尿病家族史、ERβ 基因AluI 位点多态性是影响GDM 发生的危险因素（P均＜0.05）。见表4。

表4 影响GDM发生的二元Logistic回归分析结果

3 讨论

GDM 是妊娠期常见的并发症之一，可增加妊娠期高血压、子痫前期、新生儿窒息等母婴并发症的发生风险［1］，严重威胁围生期母婴安全。近年来，随着我国二孩政策全面放开，高龄孕妇不断增加，GDM的患病率亦不断上升。GDM 的发病机制非常复杂，胰岛功能减退、胰岛素抵抗可能是其主要发病机制，年龄、肥胖、孕早期FPG 偏高、糖尿病家族史等可能是其发病的主要危险因素［6-7］。近年研究发现，遗传因素在GDM的病因学中可能具有重要作用。CHEN等［8］研究指出，有糖尿病家族史者GDM 的发病风险更高。CUI 等［9］研究认为，个体遗传变异与GDM 的发病风险密切相关。

雌激素是促进女性第二性征发育、性器官成熟的物质，主要由卵巢和胎盘（妊娠时）分泌，其受体广泛分布于子宫、乳房、盆腔等。雌激素具有多种生理作用，包括促进和维持女性第二性征，对内分泌、心血管、代谢系统以及骨骼生长和成熟等亦具有一定作用。生理浓度的雌激素可通过上调胰岛素受体表达，增加脂肪、肌肉组织等靶器官对胰岛素的敏感度，从而抑制胰岛素抵抗。妊娠期间过高水平的雌激素可对抗孕激素，从而影响胰岛素受体表达，导致靶器官对葡萄糖摄取和利用降低，继而出现GDM［10］。ERβ 是雌激素发挥生物学效应的主要介质之一，具有促进胰岛素信号转导、提高糖脂代谢相关酶活性、促进葡萄糖转运蛋白表达等生理作用。近年研究发现，ERβ 能够抑制胰岛素抵抗，其功能异常与糖尿病、胰岛素抵抗密切相关［11］。ERβ 基因定位于染色体14q22-24，由于受等位基因多态性的影响，其表达和生物学功能可能发生改变，从而引起2型糖尿病、骨质疏松症等疾病的发生［12-13］。AluI是ERβ 常见的多态性位点，位于ERβ 基因8 号外显子3。ERβ 基因AluI 位点突变可改变mRNA 稳定性和蛋白含量，导致ERβ 合成减少［13］。ZHU 等［14］报道，ERβ基因AluI位点A等位基因与女性绝经后骨密度降低、骨质疏松症的发病有关；CAI 等［15］指出，ERβ基因AluI 位点A 等位基因与男性不育有关，AluI 位点GA、GG 基因型可能是精子发生功能障碍和精子质量恶化的危险因素。但ERβ 基因AluI 位点多态性是否与GDM 的易感性有关尚不清楚，目前相关报道较少。

本研究结果显示，观察组外周血ERβ 基因AluI位点AA、Aa 基因型以及A 等位基因分布均明显高于对照组，表明A 等位基因可能与GDM 的易感性有关；进一步研究发现，携带AA、Aa 基因型孕妇罹患GDM 的风险明显高于携带aa基因型孕妇，并且携带A 等位基因孕妇罹患GDM 的风险明显高于携带a等位基因孕妇，提示GDM 发病可能具有遗传背景，携带ERβ 基因AluI 位点A 等位基因可能是GDM 发病的重要危险因素。HERRERA-LOPEZ 等［12］研究认为，ER基因rs1256031位点多态性与墨西哥人T2DM的发病风险增加有关。XIANG 等［13］研究报道，ERβ基因多态性与中国汉族妇女雌激素缺乏介导的骨质疏松症易感性增加有关。孙树凯等［16］研究发现，GDM 发病与ERβ 基因AluI 酶切位点a 等位基因有关，携带a 等位基因孕妇GDM 的发病风险是携带A等位基因的1.559 倍，但本研究结论与其不同，其原因可能与地域、种族、样本量等差异有关。因此，外周血ERβ 基因AluI 位点多态性与GDM 易感性的关系尚需多中心、大样本量研究加以验证。

糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗是GDM 的重要病理表现，两者相互作用，形成恶性循环，从而加速胰岛功能衰退。本研究结果发现，观察组FPG、FINS、HOMA-IR、TC 均明显高于对照组，说明GDM 孕妇已出现明显的糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗。李丹丹等［17］研究报道，遗传变异可能与胰岛β 细胞功能障碍和胰岛素抵抗有关。糖尿病前期人群KCNJ11 基因多态性可能影响其糖脂代谢［18］。提示某些基因多态性可能与糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗有关。本研究结果显示，GDM 孕妇外周血ERβ基因AluI位点AA、Aa基因型者FPG、FINS、HOMA-IR、TC均高于aa基因型者，说明ERβ 基因AluI 位点多态性与GDM孕妇糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗有关，携带ERβ 基因AluI位点A等位基因孕妇糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗的发生风险更高。单因素分析发现，观察组孕前BMI、孕前收缩压、糖尿病家族史、FPG、FINS、HOMA-IR、TC、妊娠早期体质量增加、妊娠中期体质量增加均高于对照组，而两组年龄、孕前舒张压、TG

比较差异均无统计学意义；二元Logistic 回归分析发现，FPG、糖尿病家族史、ERβ 基因AluI 位点多态性是影响GDM 发生的危险因素。进一步证实，外周血ERβ基因AluI位点多态性与GDM的易感性有关。综上所述，外周血ERβ 基因AluI 位点多态性与GDM 的易感性密切相关，携带A 等位基因孕妇可能是GDM 易感的高危人群，并且与GDM 糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗有一定关系。