Hath1基因在增生性息肉与锯齿状腺瘤/息肉中的表达及鉴别意义①

尹 源，郑知强，谢 锐，林凡榆，梁 龙

（1成都三六三医院消化内科，2四川省肿瘤医院肿瘤科，成都610041）

无蒂锯齿状腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P)好发于右侧结肠，是结直肠癌的前驱病变之一[1]。其内镜下表现为柔软光滑，扁平无蒂，表面苍白，通常覆有黏液，往往边界不清[2]。根据世界卫生组织（WHO）提出的第4版《消化系统肿瘤分类》，SSA/P出现不典型增生或癌变时，可能表现出蒂生长、发红、中央凹陷等特征[3]。但在疾病早期或进展隐匿时，限于镜头方位、病灶大小或其他伪影，仅凭内镜检查鉴别增生性息肉(hyperplastic polyp,HP)与SSA/P的难度较大，尤其在病变位于左半结肠时，HP结肠黏膜的脱垂与SSA/P的形态容易混淆[4]。但是HP和SSA/P在癌变风险、治疗方案和随访策略等方面显著不同[5]。因此寻找一种具有高特异性和敏感性的生物标志物辅助形态学进行判断将有望提高诊治的准确性，然而目前尚缺乏高效率的理想标记物[6]。Notch信号在肠道发育和内稳态中起着重要作用，有研究发现Hath1在人和小鼠肠上皮细胞核中均有表达，其表达水平会受到Notch信号通路中Hes1基因的抑制，并可以通过调节肠细胞的分化而影响肠道发育[7]。本研究比较了Hath1基因在HP和SSA/P中表达，从而探究其在二者鉴别诊断中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年4月—2019年12月在成都三六三医院接受内镜及病理检查的患者作为研究对象，调取其病理诊断电子管理系统中相关资料。所有病例阅片由3名相同的病理专家独立进行，当诊断一致时即纳入本次研究。纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)既往未接受全结肠镜检查；(3)病理诊断为锯齿状息肉或传统腺瘤。排除标准：(1)合并炎症性肠病；(2)合并遗传性的肠道疾病，如增生性息肉综合征、遗传性非息肉性结肠癌、家族性腺瘤性息肉病等；(3)合并有其他系统的恶性肿瘤；(4)既往接受过肠道手术；(5)数据缺失，相关临床资料不全。纳入本次研究的患者共计92例，其中HP组31例，男性19例，女性12例，年龄35～79岁，平均年龄(61.3±5.1)岁；10例病变位于右半结肠，21例病变位于左半结肠；粘蛋白分布亚型包括2类，其中5例杯状细胞型锯齿状息肉，26例微泡状黏蛋白型锯齿状息肉，未发现黏蛋白缺失型息肉。SSA/P组患者61例，男性34例，女性27例，年龄36～75岁，平均年龄(59.1±6.2)岁，45例病变位于右半结肠，16例病变位于左半结肠。此外还收集了4例SSA/P伴异型增生患者，17例传统锯齿状腺瘤（TSA）患者，11例管状腺瘤（TA）患者，以及20例正常的结直肠组织作为对照组，对比分析Hath1在不同病变中的免疫组化染色特征。

1.2 不同病变的病理学特征（1）HP组织：①多位于直肠或远端结肠，镜下呈水滴珍珠色，形态扁平轻微隆起；②细胞排列整齐，总体靠基底侧；③细胞核形态一致，体积偏小；④隐窝长、直，典型锯齿状结构占表面1/2以上，基底狭窄，多为非锯齿状结构；⑤覆盖有杯状上皮及柱状上皮；⑥无明显的结构异常及不典型细胞。（2）SSA/P组织：①组织异形：具有明显的深隐窝锯齿，畸形隐窝紧贴黏膜肌层横向生长，呈烧杯底状、L型或倒T型；②细胞异型：癌变风险高，常出现上皮异常增殖，但细胞、结构学改变达不到低级别恶变；③病灶直径5～9 mm，常见于右半结肠发病。（3）传统TSA组织：①细胞、结构改变符合低级别恶变标准，但黏膜与畸形的隐窝不相邻，且异型增生位于隐窝上1/2；②病灶隆起、有蒂，表面呈脑回状，多发于左半结肠。（4）TA组织：①表面光滑，包膜完整。剖面呈棕黄色，散布大小不均的含粘液囊腔；②由双层排列的立方或柱状上皮细胞组成，互相吻合成狭长的小梁状或不规则的小管状；③胞浆嗜酸性，细胞核呈卵圆形，体积偏大，大小均一；④间质与实质间有基底膜分隔，间质疏松，其中有大量小静脉和毛细血管。小梁外周或管腔没有上皮细胞，管腔内分泌物糖原染色（PAS）阳性。

1.3 Hath1免疫组化染色 Hath1在组织标本中的表达通过免疫组化方法进行检测。组织切片先依次于二甲苯及梯度乙醇中脱蜡，再利用热效应修复抗原，封闭采用0.3%过氧化氢，阻断采用血清进行孵育。一抗为购自Millipore Chemicon公司的Hath1兔单克隆抗体（AB5692），孵育24 h。之后以二抗（生物素标记）和亲和素（辣根过氧化物酶标记）与样品孵育，以二氨基联苯胺（DAB）法染色。染色结果由两名经验丰富的研究者独立评估。染色强度采用半定量法分4级：3级(强染色)、2级(中度染色)、1级(弱染色)、0级(无染色)。阳性细胞百分率分为4级：3分(＞50%)、2分(31%～50%)、1分(1%～30%)、0分(0%)。总体染色阳性的判定：总积分=强度分数×阳性百分率分数，＞2分记为“阳性”、0～2分记为“阴性”。

1.4 统计学分析 利用SPSS 25.0软件分析数据。计数资料以例（%）表示，Hath1在HP和SSA/P中的表达率差异用Fisher精确检验(双尾)比较。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 正常组织和HP中Hath1的表达 在正常结肠黏膜中，Hath1染色见于固有层的间质性炎症细胞、隐窝细胞和上皮细胞的细胞核，染色强度一致(图1A、1B)。以间质炎症细胞的强度为染色阳性标准。在HP组织中，Hath1在微泡(26/26,100%，图1C～1F)和杯状细胞(5/5,100%，图1G、1H)的隐窝内均有与正常结肠黏膜强度一致核染色。

图1 Hath1在正常结肠黏膜和增生性息肉中的表达

2.2 SSA/P和SSA/P伴异型增生中Hath1的表达在SSA/P组织中，56例（91.8%）隐窝细胞核Hath1染色非常微弱或缺失(图2A～2F)，5例（8.2%）隐窝细胞核Hath1染色阳性的组织均来自左侧（直肠3例，乙状结肠2例）。Hath1染色阳性率在息肉部位（χ2=31.452）或者SSA/P及HP（χ2=53.157）中的差异具有统计学意义（P均＜0.01），见表1。进一步由表2计算得出，以Hath1表达缺失为标准鉴别HP和SSA/P的敏感性为91.81%，特异性为100%。而在所有伴异型增生的SSA/P组织中，可观察到Hath1有不同的染色表现，往往在发育不良的上皮细胞质中呈现弥漫性的阳性染色(图2G～2H)。

表1 HP和SSA/P组织在不同病灶定位中的Hath1染色阳性率比较

表2 Hath1表达降低与病理诊断结果的关系

图2 Hath1在SSA/P和SSA伴异型增生中的表达

2.3 HP黏膜脱垂组织中Hath1的表达 染色结果显示，在HP黏膜脱垂的扭曲隐窝中Hath1的核表达与正常组织和HP组织保持一致。见图3。

2.4 TSA和TA中Hath1的表达 在TA中，Hath1表达为大部分的强阳性的核染色，同时伴有部分斑片状阴性表达(图4A、4B)。在TSA中，Hath1表达呈混合模式，同时有局灶性的表达缺失和强阳性核染色(图4C、4D)。

图3 Hath1在HP黏膜脱垂中的表达

图4 Hath1在管状腺瘤和传统锯齿状腺瘤中的表达

3 讨论

SSA/P最早由Torlakovic等[8]报道，多为发生于结直肠的锯齿状息肉，外表类似于HP，但是组织构造差异较大。依照WHO的建议，这一类型的息肉现被命名为无蒂锯齿状腺瘤/息肉[9]。SSA/P具有恶变倾向，是右半结直肠癌的高危因素，并且进展较快，约有30%的结直肠癌继发于SSA/P[10]。因此早期识别和科学干预是阻止不良预后的关键。但明确SSA/P的诊断较为困难，往往需要形态学与分子学的联合应用。

Hath1是一种转录因子，它能抑制结肠癌细胞的增殖，其在组织中的缺失可能意味着恶变潜能的提高[11]。与Zhu等[12]的报道一致，本研究证实了Hathl基因表达于正常肠黏膜组织中的细胞核。进一步探究其在不同病变组织中的表达情况，结果显示在SSA/P组织中Hathl的表达阳性率明显低于HP组织（P＜0.05）。与病理检查这一金标准结果进行比较，以Hath1表达缺失为标准鉴别HP和SSA/P的敏感度为91.80%，特异度为100%，具有较高的辅助诊断意义。

此外，在本组资料中还存在部分位于左半结肠的息肉具有与SSA/P一致的形态，但仍然存在较强的阳性核染色。考虑其原因主要是：（1）右侧的SSA/P通常显示Hath1的均匀丢失，而左侧的SSA/P可以维持Hath1的表达，这可能与表观遗传特征差异有关。（2）左侧息肉镜检时难度较大，还可能出现镜下伪影等各种因素，因此难以与SSA/P明确区分，存在一定观察偏倚。

本研究结果提示，在形态学上SSA/P与伴黏膜脱垂的HP更加容易混淆，但是伴黏膜脱垂的HP中Hath1的核染色在扭曲的隐窝中也依然保持不变，可为鉴别诊断提供参考。在SSA/P发育不良的上皮中，本研究在细胞质中观察到弥漫性的Hath1阳性染色，这提示Hath1的位置发生了变化，这可能是Hath1信号通路失调导致的[14]。而TA和TSA作为重要的恶性肿瘤先兆，既往有研究显示，Hath1往往会在TA组织中表达上调[13]。而在本研究中，TA中Hath1表达为大部分的强阳性的核染色，同时伴有部分斑片状阴性表达。由于在固有层炎症细胞中Hath1也能够表现出均匀且强度较大的染色，因此这种混合染色模式为伪影的可能性很小，可能是TA的表观遗传多样性所致的差异。而T SA也是一类具有较强遗传异质性的疾病[15]，在本研究中同样表现出了混合模式，即同时存在局灶性的表达缺失和强阳性核染色。

由于能够明确诊断的病例数相对较少，因此本研究样本量偏低，存在一定局限性。下一步将适当纳入更多符合标准的病例，从而为指导临床工作提供可靠依据。

综上所述，本研究发现，在SSA/P中Hath1的表达可能较正常结肠黏膜或HP组织减弱甚至完全消失；在伴有异常增生的SSA/P上皮中，Hath1弥漫性表达于胞浆；TA和TSA组织中则显示出与上述表现不同的混合染色模式。而Hath1的表达缺失鉴别HP与SSA/P具有较高的灵敏度和特异性，有望成为辅助诊断SSA/P的重要标记物。