OSCC和OLK患者口腔黏膜组织中IL-12p35和Ebi3的表达及意义*

王方方，江南，罗亮，蔡扬***

(1.贵州医科大学 口腔医学院，贵州 贵阳 550004；2.贵阳市口腔医院 牙周病科，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学附属口腔医院 牙周黏膜科，贵州 贵阳 550004)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是一类起源于口腔黏膜上皮衬里、具有侵袭性的肿瘤，其5年生存率约为50%[1-2]。口腔白斑(oral leukoplakia，OLK)是最常见的口腔黏膜潜在恶性疾患或病变，每年有1%～3%向OSCC转化，上皮异常增生程度决定了其癌变潜能[3-4]。白细胞介素35(interleukin-35,IL-35)是由α链p35亚基(interleukin-12p35，IL-12p35)和β链EB病毒诱导基因3(epstein-barr virus-induced gene 3，Ebi3，也称IL27b)组成的异源二聚体[5]，具有强大的免疫抑制及抗炎特性，通过抑制凋亡及限制抗肿瘤T细胞免疫力促进肿瘤细胞生长；由于其非共价异二聚体结构，IL-35还可作用于肿瘤细胞，从而直接影响癌细胞的存活[6-7]，然而IL-35在口腔黏膜癌前病变及其癌变为恶性肿瘤过程中的作用方式及机制尚不清楚。因此本研究通过了解IL-35两亚基在OLK和OSCC组织中的分布及表达强度，探讨其在口腔黏膜癌变中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本来源 收集2014年9月—2016年5月临床和病理资料完整的OLK和OSCC患者分别作为OLK组和OSCC组，要求所有患者组织病理学确诊为OLK或OSCC原发病例、同时未接受放化疗、靶向治疗等、且无合并其他肿瘤性病变，排除复发病例及合并系统性或传染性疾病者；同时取行正颌手术和良性非炎症性肿瘤切除术患者作为正常组。共收集到OLK组患者32例，男22例、女10例，年龄38～60岁、平均(43.75±4.33)岁，单纯增生性白斑、轻度异常增生、中度异常增生及重度异常增生分别有14、13、2及3例；OSCC组患者34例，男24例、女10例，年龄40～78岁、平均(61.76±9.27)岁，高、中及低分化者分别有13、18及3例，淋巴结转移20例，Ⅰ～Ⅱ期10例、Ⅲ～Ⅳ期24例；正常组患者15例，男8例、女7例，年龄18～36岁、平均(27.00±4.21)岁。切取3组受试者适当大小口腔黏膜组织，10%中性甲醛固定后常规石蜡包埋，所有标本经苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin，HE)染色后行形态学观察及病理学诊断。本研究经医院伦理学委员会审批[2014伦审第(06)号]，并获得所有受试者的知情同意。

1.1.2主要试剂 兔抗人IL-12p35多克隆抗体(美国Abcom)，鼠抗人Ebi3单克隆抗体(英国Novus)，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗 原 修 复 液(pH=9.0)、PV6001山羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)聚合物及PV6002山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物(北京中杉)。

1.1.3主要仪器 超净工作台(苏州净化设备有限公司)、超低温冰箱(中科美菱)、Nikon YS100光学显微镜(日本Nikon)、低温高速离心机(美国Themo-hereus Sientific Frescol)及微量移液器(德国Eppendorf)。

1.2 方法

1.2.1免疫组织化学超敏二步法[8](immunohistochemistry，IHC) 采用IHC检测3组受试者口腔黏膜组织中Ebi3、IL-12p35表达情况，阳性对照使用人胎盘组织，阴性对照以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗。检测时采用高温高压抗原修复，将切片置于装有EDTA抗原修复液的修复盒内，修复盒置于高压锅高温加热3.5 min，一抗稀释浓度分Ebi3为1 ∶100、IL-12p35为1 ∶300，二抗工作液IL-12p35使用山羊抗兔IgG/HRP聚合物、Ebi3使用山羊抗鼠IgG/HRP聚合物，其余步骤严格按照试剂盒说明进行操作。

1.2.2染色结果判定 阳性染色表现为明确黄色或棕黄色颗粒，EBi3和IL-12p35阳性表达于细胞膜及细胞浆，按照Fu等[9]方法进行分析。随机选取5个400倍视野观察，计算视野中阳性细胞数的平均百分比，规定阳性细胞平均百分比≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%及>75%分别评为0、1、2、3及4分；同时观察细胞染色强度，规定细胞无染色、淡黄色、棕黄色及棕褐色分别评为0、1、2及3分，以上2项评分之积综合判定染色结果，规定总分0～2分为阴性(-)、3～5分为弱阳性(+)、6～8分为中度阳性(++)及9～12分为强阳性(+++)，其中弱阳性、中度阳性及强阳性计为阳性表达[10]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 IL-12p35和Ebi3表达

正常组患者口腔黏膜组织IL-12p35和Ebi3蛋白均为阴性表达；OLK组患者组织从单纯性增生白斑开始出现IL-12p35、Ebi3阳性细胞，均散在分布于基底层，且随上皮异常增生程度的增加，IL-12p35、Ebi3阳性细胞可位于棘细胞浅层甚至全层；OSCC组患者组织中IL-12p35阳性细胞呈环状散在分布于癌巢周围，Ebi3阳性细胞除了分布于癌巢周围外，还分布于肿瘤间质浸润的淋巴细胞(图1)。OLK及OSCC组患者口腔黏膜组织中IL-12p35、Ebi3蛋白的阳性表达率均高于正常组(P<0.01)，且OLK与OSCC组间Ebi3蛋白的阳性表达率差异有统计学意义(P<0.001，表1)。Spearman相关分析结果显示，IL-12p35、Ebi3蛋白阳性表达分别与上皮异常增生程度呈正相关关系(rIL-12p35=0.370，P=0.001；rEbi3=0.380，P<0.001)。

表1 各组患者口腔黏膜组织IL-12p35和Ebi3蛋白的阳性表达[n(%)]Tab.1 The positive expression rate of IL-12p35 and Ebi3 protein in oral mucosa of each group[n(%)]

注：A、D为正常组，B、E为OLK组，C、F为OSCC组。图1 各组患者口腔黏膜组织 IL-12p35和Ebi3的表达(HE，×400)Fig.1 Expression of IL-12p35 and Ebi3 in oral mucosa of each group(HE，×400)

2.2 IL-12p35、Ebi3蛋白表达与OSCC组患者临床病理特征的关系

研究结果显示，OSCC组患者IL-12p35、Ebi3蛋白表达与患者淋巴结转移有关(P<0.05)，但与性别、年龄、分化程度及TNM分期无关(P>0.05)。见表2。

表2 OSCC组患者IL-12p35和Ebi3的表达与其临床病理特征的关系Tab.2 The relationship between IL-12p35,Ebi3 and clinicopathological characteristics of OSCC group

3 讨论

口腔黏膜癌前病变或癌前状态目前只能通过组织病理学明确诊断，而多数口腔癌变早期仅表现为一系列上皮变化，病变面积小且无明显症状，通常在症状中晚期才被发现，生物标志物的使用有望作为口腔黏膜癌变诊断组织病理学的补充[11-12]。IL-35是近年来发现的主要由调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)分泌的一种具有免疫抑制功能的细胞因子，由Ebi3、IL-12p35两个亚基组成，属于IL-12家族成员[13-14]。与IL-12家族其他成员不同的是，IL-12p35和Ebi3以独立的亚基形式分泌，在炎症条件下两亚基结合形成生物活性异源二聚体[15-16]。Ebi3是一种34 kDa糖蛋白，在人类疱疹病毒(epstein-barr virus，EBV)转化的B淋巴细胞、扁桃体、脾脏及胎盘滋养层中均有表达[17]；IL-12p35在大多数组织细胞中表达，并参与细胞分泌过程[5，18]。IL-35介导的免疫调节分子机制因肿瘤类型而异，如在乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌中IL-35高表达，协助肿瘤免疫逃逸、促进肿瘤进展[19-20]；也有研究表明IL-35的增加可刺激细胞凋亡减少肿瘤发生，这可能是由于癌症不同阶段或肿瘤细胞微环境的差异所致[21-24]。

本研究结果表明，正常组患者口腔黏膜中Ebi3、IL-12p35无表达，OLK组从单纯性增生组织开始出现阳性表达，2种蛋白在肿瘤发生形态学变化过程的初期即表达异常，提示IL-35两亚基表达上调可能是口腔黏膜癌变过程中的早期事件；OSCC组患者Ebi3和IL-12p35蛋白表达随口腔黏膜组织恶性程度的增加而增高，提示种蛋白2者免疫抑制作用在OSCC发展过程中呈增强趋势，据此推测在OSCC癌变过程中IL-35抑制作用增强，使肿瘤细胞失去正常的机体免疫识别、调控及清除能力，细胞不受调控无限增殖而导致了癌症进展。Ebi3、IL-12p35阳性率在OLK组织中随上皮异常增生程度增加而升高，提示IL-35异常表达可能参与癌前病变的发生发展，由于癌前细胞因基因不稳定且具有很强的免疫原性，可使细胞绕过免疫细胞识别，从而阻碍肿瘤定向免疫反应；同时Ebi3、IL-12p35在肿瘤微环境中免疫抑制增强，肿瘤细胞免疫逃逸随之加重，细胞凋亡程序被抑制，从而促进癌前状态发展[5]。此外，OLK组和OSCC组患者组织中Ebi3阳性表达率差异有统计学意义(P<0.001)，提示Ebi3的表达上调与肿瘤恶性程度及癌变进程相关，可能由于Ebi3参与肿瘤微环境的免疫逃逸，从而抑制免疫细胞诱导的抗肿瘤活性。Ebi3、IL-12p35蛋白水平与OSCC组患者有无淋巴结转移有关，提示IL-35是口腔黏膜恶性转化可能诊断和判断预后的一种新型检测指标。

综上，本研究结果表明Ebi3、IL-12p35蛋白在OSCC组、OLK组患者口腔黏膜中表达上调，提示IL-35的异常表达可能参与了OSCC及口腔黏膜癌变的发生发展。