新型冠状病毒重要药物靶标结构生物学及药物抑制机制研究

高海龙，王镐锋，赵耀，高岩，王权

①上海科技大学 免疫化学研究所，上海 201210；②上海科技大学 生命科学与技术学院，上海 201210

新型冠状病毒肺炎疫情由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起，而SARS-CoV-2属于套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）[1]，是一类宿主范围广泛的单股正链RNA病毒。目前，已经鉴定出7种感染人的冠状病毒，而新型冠状病毒SARS-CoV-2与2003年间流行的SARS冠状病毒在基因组序列上的相似性最高；同时，两种病毒使用相同的宿主细胞表面受体（血管紧张素转换酶2，ACE2）进入细胞，引起呼吸道症状，可能发展为严重肺炎并引起患者死亡[2]。此外，与SARS冠状病毒相比，SARS-CoV-2具有更低的致死率，大多数感染者症状轻微，并且还有许多无症状感染病例出现。这些特性使得SARSCoV-2具有更高的传播率，人际传播更为迅速，从而引起大流行。

新冠病毒的复制增殖由其基因组中的开放阅读框1a （ORF1a）和开放阅读框1ab （ORF1ab）编码的多种非结构蛋白（nsps）负责，这些蛋白最初翻译为多蛋白，然后进行蛋白酶切割以及成熟。其中，主蛋白酶（Main protease,Mpro）切割产生非结构蛋白nsp4～nsp16，促使各种非结构蛋白的水解成熟。切割后蛋白质根据功能特点，分别行使病毒增殖过程中相应功能，转录复制相关蛋白会自组装成转录复制复合体（replication and transcription complex,RTC），催化病毒基因组的转录与复制过程。其中，非结构蛋白12 （nsp12）是具有RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）活性的核心催化亚基。单独nsp12的聚合酶反应效率很低，而辅因子nsp7、nsp8的存在会明显促进nsp12的聚合酶活性[3]。因此，研究人员将nsp12-nsp7-nsp8复合体定义为催化冠状病毒RNA合成的最小核心单元。在基因组完整转录与复制过程中，还需要其他非结构蛋白参与组装完整的转录复制复合体，如nsp9、nsp10、nsp13、nsp14、nsp16等。更高层级的复合物状态及其发挥功能的机理尚不清楚，需要进一步结构生物学证据阐明。由于宿主的免疫选择，病毒的表面抗原蛋白易于发生突变，与之相比，病毒蛋白酶和聚合酶发生突变的概率较小，并且具有更高的进化稳定性，显示出作为广谱抗病毒药物靶标的巨大前景。全球科学家致力于寻找潜在的药物以治疗新冠患者，Mpro和RdRP由于在病毒生命周期中发挥着重要作用，被认为是新冠病毒药物开发的两大重要靶点。因此，了解SARS-CoV-2主蛋白酶和聚合酶复合物的结构和功能是开发新型治疗药物的必要前提。

随着疫情扩大，我国科研工作者积极响应国家需要，迅速投入到阻击疫情的科研第一线。各研究团队系统研究了新冠病毒侵染增殖过程，解析了关键药物靶点主蛋白酶Mpro和转录复制复合体多个状态的三维结构，阐明了病毒转录复制的功能机制，同时为发展高效抗病毒药物提供了关键结构基础，先后在《自然》（Nature）、《科学》（Science）、《细胞》（Cell）等国际期刊上发表系列研究论文，为国际抗新冠病毒药物的研究做出了重要贡献。

1 新冠病毒主蛋白酶Mpro的靶向药物开发

疫情暴发伊始，上海科技大学免疫化学研究所杨海涛研究员、饶子和院士团队，与中国科学院上海药物研究所蒋华良院士团队等组成的新冠病毒应急攻关团队，基于实验室早年在抗SARS病毒药物研究上积累的经验，开展新冠病毒结构生物学及抗病毒药物研究。攻关团队在获得主蛋白酶基因序列信息后，快速表达纯化了新冠病毒主蛋白酶Mpro并解析了其高分辨率晶体结构。

2020年1月26日，研究团队在国际上率先公布新冠病毒Mpro的三维结构原子坐标。随后向国内外300多家高等院校、科研院所以及药物研发企业分享首个新冠病毒蛋白三维结构信息，2月5日由国际蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）公开发布。同时，该结构也被评为2020年2月国际蛋白质结构数据库的“明星分子”。

2020年4月9日，该项成果受邀在Nature杂志在线发表[4]。文章详细描述了新冠病毒主蛋白酶的三维空间结构，并基于该结构进行药物筛选，通过分子、细胞药效实验评估候选药物的酶活抑制效果，发现数个具有较强病毒抑制作用的小分子。首先，攻关团队表达纯化了分子量约为33.8 kDa的Mpro蛋白，并利用荧光共振能量转移技术（FRET）对蛋白活性进行了分析，通过计算机辅助药物设计技术和分子对接技术，结合体外酶活抑制实验分析了候选分子N3可能是Mpro蛋白的不可逆抑制剂。随后，攻关团队制备了主蛋白酶和N3的复合物晶体，利用上海同步辐射光源大科学装置收集了晶体衍射数据，并很快解析了复合物晶体结构。接下来，研究团队通过高通量筛选技术和基于结构的虚拟筛选技术，成功筛选到7种潜在的候选药物，其中双硫仑（Disulfiram）和卡莫氟（Carmofur）是FDA已批准上市的药物，研究团队分析了多种药物与Mpro的结合方式和成药潜力。最后利用细胞实验评估了药物的抗病毒效果，其中Ebselen和N3表现出较强的病毒抑制作用。

该工作详细地阐释了新冠病毒Mpro蛋白与小分子抑制剂N3的复合物结构，综合利用三种不同的药物发现策略筛选了一批潜在药物，并结合体外酶活实验和细胞水平的抗病毒实验验证了部分药物的抗病毒效果。这些研究成果将助力人们对于新冠病毒的认知，也将推动未来抗新冠病毒的临床药物研发。

2 新冠病毒转录复制复合体的结构与功能机制

2.1 新冠病毒RdRP复合物的整体结构

RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP，又称nsp12）负责病毒RNA的合成，是冠状病毒转录复制的核心元件，同时也是抗病毒药物瑞德西韦（Remdesivir）、法匹拉韦（Favipiravir）等的主要靶点。病毒的RNA聚合酶nsp12与辅因子nsp7和nsp8组成了转录复制机器的核心单元。

2020年4月10日，饶子和院士领导新冠病毒攻关小组报道了新冠病毒全长nsp12与辅因子nsp7和nsp8复合物的冷冻电镜结构，分辨率为2.9 Å （PDB ID:6M71）[5]。

新冠病毒的聚合酶nsp12包含一个经典的“右手”聚合酶结构域，以及一个套式病毒目特有的核苷酸转移酶（NiRAN）结构域[6]。其中，聚合酶结构域可细分为手指、手掌、拇指三个亚结构域，与经典的病毒聚合酶结构域排布相同[7]。在结构中，研究者们首次定位了β-hairpin结构域，插入在NiRAN和手掌亚结构域形成的沟槽内，维持了结构稳定。此前研究中报道提示瑞德西韦、法匹拉韦等核苷类化合物是潜在的抗冠状病毒药物，研究者分析了三磷酸形式瑞德西韦与复制酶复合物的可能结合方式，为阐明药物小分子和聚合酶药物靶点的结合模式提供了结构基础。2020年5月30日，中国科学院微生物研究所施一研究组发表研究论文[8]，描述了新型冠状病毒聚合酶复合物（nsp12-nsp7-nsp8）结构，并通过一系列生化实验揭示，SARS-CoV-2聚合酶活性低于SARS-CoV，单个蛋白组分的热稳定性降低，为不同冠状病毒的适应性进化提供了线索。

在药物研发过程中，一种新药的发现必然经历漫长的研发过程，研发时间长，投入产出比小。因此，寻找已上市药物的新适应症成为极具吸引力的策略。在已上市药物的原适应症之外开发药物新靶点、新用途的过程就称为“老药新用”。“老药新用”是一种快速高效的筛选策略，这些潜在药物分子具有已经证实的药代动力学性质及安全性评价，因此可以避免药物研发前期漫长而高昂的评价过程，从而降低研发成本，缩短研发时间。截至目前，针对新冠肺炎，已经开展了多种成药的临床试验，其中瑞德西韦和法匹拉韦作为明星分子，最受人关注。

2.2 瑞德西韦抑制病毒RNA复制酶的“延迟终止”机制

瑞德西韦，是一类核苷类似物前体药，在体内代谢为具有生物活性的三磷酸形式瑞德西韦。它由吉利德公司研发，最早用于治疗埃博拉病毒和马尔堡病毒感染。

在了解新型冠状病毒核心转录复制复合体结构后，为阐述聚合酶催化机制以及瑞德西韦抑制机理，饶子和院士联合团队解析了聚合酶与辅助因子、RNA及抗病毒候选药物瑞德西韦复合体2.9 Å的三维结构，揭示了新冠病毒聚合酶复合体发挥活性过程中“转位前”和“转位后”两种不同生理状态构象特征[9]。

通过对解析结构的研究发现，三磷酸活性形式的瑞德西韦分子经由病毒聚合酶催化，成功“混入”了产物RNA中，并进一步转位至上游产物，形成“转位后”复合体。结合生化与结构数据结果，验证了瑞德西韦能够“混入”RNA产物并与上游产物退出通道中861位丝氨基酸产生强烈的位阻效应，从而阻碍RNA合成继续进行，发挥其“延迟终止（delayed chaintermination）”的抑制效果。

目前对SARS冠状病毒RNA聚合酶的活性研究显示，nsp7和nsp8对RNA聚合酶介导的病毒新生RNA合成反应至关重要，但其确切的生理功能尚不明晰。该研究捕捉到反应进入稳定延伸阶段后，新冠病毒RNA聚合酶复合物中两个nsp8分子N端结构域的构象出现大幅度变化。两个nsp8分子的N端部分相互靠拢，在产物RNA上游退出路径中构成一个结构性平台，对新生RNA转位和快速行进起到重要作用。至此，新冠病毒非结构蛋白nsp7和nsp8作为RNA聚合酶复合物中必不可少的一部分，其结构基础及生理意义得到充分阐述。文章引用了团队多年前在冠状病毒nsp7/nsp8十六聚体引物酶方向的研究[10]，提出了引物酶复合体向聚合酶复合体过渡的动态转换模型，进一步深入探究了新型冠状病毒转录复制的分子机理，为靶向转录复制过程的抗新冠肺炎药物开发与设计开辟了新途径。

与此同时，2020年5月1日，中国科学院上海药物研究所徐华强研究团队解析了新冠病毒复制酶与瑞德西韦复合物结构[11]。首先使用昆虫表达体系共表达了新冠病毒的聚合酶三元复合物，通过凝胶迁移实验（EMSA）验证了聚合酶复合物与RNA的结合，三磷酸形式瑞德西韦可抑制聚合酶活性；同时，首次利用了体外生化实验，建立了新冠病毒复制酶活性的测定方法，并且通过三磷酸形式瑞德西韦和瑞德西韦设计和建立了药物抑制试验，验证了三磷酸形式瑞德西韦是最终发挥活性的小分子形式。通过冷冻电镜获得了2.8 Å分辨率的apo复合物结构和2.5 Å分辨率的复制酶/RNA/瑞德西韦复合物，两个结构总体上较为接近，在聚合酶结构域中D618和S814参与了催化中心两个镁离子的配位。

2.3 法匹拉韦抑制新冠病毒机制

法匹拉韦，主要用于治疗成人新型或再次流行的流感，其作用机制为在病毒基因组复制过程中，模仿嘌呤类核苷酸，掺入病毒子代基因组RNA中，诱导病毒子代遗传物质突变，进而抑制病毒正常增殖。这一类抑制效果与瑞德西韦或其他引起病毒RNA合成链终止反应的核苷类似物不同。

中国科学院微生物研究所施一、齐建勋研究团队，解析了法匹拉韦与新冠聚合酶复合物的三维结构[12]，揭示了法匹拉韦和嘧啶残基之间独特的碱基配对方式，描绘了法匹拉韦模仿嘌呤类核苷酸的分子形态，并与嘧啶类核苷酸相互作用的分子机制。

2.4 苏拉明抑制新冠病毒RNA复制酶机制

在针对病毒RNA聚合酶的抑制剂开发过程中，根据抑制剂化学结构和作用方式的区别，可将其分为核苷类抑制剂以及非核苷类抑制剂。核苷类抑制剂，如瑞德西韦、法匹拉韦等，通过细胞代谢为有活性的三磷酸形式药物，进而被聚合酶使用，水解为单磷酸形式药物，并以单磷酸形式掺入子代链中，抑制病毒的正常复制过程。非核苷类抑制剂，可不需要体内代谢为活性三磷酸形式，而是直接作用于病毒的聚合酶，影响病毒正常复制过程。非核苷类抑制剂的开发，可以有效规避核苷类药物的细胞毒性，并与其他作用机制的药物协同作用。

中国科学院上海药物研究所徐华强研究团队在新型冠状病毒非核苷类抑制剂开发研究中，通过新型冠状病毒聚合酶活性筛选体系，在成药库中筛选活性化合物，发现一类老药苏拉明可以有效抑制新冠病毒RNA聚合酶活性，药效优于三磷酸形式瑞德西韦；同时，细胞水平上也显示出较强的抗病毒活性。通过冷冻电镜技术，解析了苏拉明与新型冠状病毒聚合酶的复合物结构，每个复合物含有两个苏拉明分子，分别位于模板链结合位点和引物链所在的催化活性中心[13]。苏拉明带强负电性，可有效抑制核酸与聚合酶结合，进而抑制聚合酶活性。该研究发现并描述了非核苷类抑制剂对新型冠状病毒聚合酶作用机制与结构细节，为靶向新型冠状病毒聚合酶的抑制剂开发提供新的思路。

2.5 新冠病毒 RNA延伸与帽结构合成中间状态cap（-1）′-RTC的分子机制

在侵入宿主细胞后，新冠病毒开始了宿主内的生命周期，病毒编码的多个非结构蛋白可以通过组装形成转录复制复合体，负责病毒的转录复制与RNA的加帽过程。组装形成转录复制机器的元件包括聚合酶、解旋酶、甲基转移酶等，对病毒生命周期有着重要意义，是关键的抗病毒药物靶点。

饶子和院士研究团队通过核酸分子的优化设计，摸索了复合物形成的合适构建条件，成功组装了新冠病毒延伸状态下的转录复制复合物（elongation replication and transcription complex,E-RTC），并解析了2.9 Å分辨率的冷冻电镜结构。该复合物由1个nsp12分子、1个nsp7分子、2个nsp8分子、2个nsp13分子及核酸链组装而成，关键的结构信息解释了解旋酶分子如何协同聚合酶完成转录复制和RNA合成过程中错配回溯的分子机制[14]。

转录完成后的新冠病毒产物RNA需要一个成熟加帽的过程，该帽结构可以帮助病毒RNA在宿主核糖体中翻译，并且逃避宿主先天免疫。新冠病毒中的帽结构形成、加工和修饰主要可分为以下四个步骤：①在RNA 5'-三磷酸酶（RTPase）活性下将pppA-RNA转变成ppA-RNA[cap（-2）]；②在鸟苷转移酶（GTase）活性下转化生成GpppA-RNA[cap（-1）]；③在N7-MTase酶活性下生成7MeGpppA-RNA[cap（0）]；④在2'-O-MTase活性下生成7MeGpppA2'OMe-RNA[cap（1）][15]。在冠状病毒加帽过程的第二步，也就是鸟苷转移酶GTase活性，究竟由哪个蛋白或蛋白结构域完成，一直是未知的。为探讨加帽过程的分子机制，研究团队通过优化设计，成功组装了第二步过程后的中间过渡状态，即cap（-1） '-RTC的转录复制复合体，并解析了该复合物在2.8 Å分辨率下的冷冻电镜结构[16]。在该复合物结构中，单链核酸结合蛋白nsp9结合在聚合酶nsp12的N端核苷转移酶（NiRAN）结构域上，使得整个加帽过程卡在第二步到第三步的过渡态上。接下来，团队通过生化实验，证实了nsp12的NiRAN结构域可以催化完成RNA加帽的第二步反应，执行鸟苷转移酶（GTase）活性，该关键酶分子的确认也使得NiRAN结构域成为抗病毒研发的新靶点。

2.6 新冠病毒mRNA加帽及基因组复制矫正的分子机制

新型冠状病毒含有目前已知最大的RNA病毒基因组，共约30 kb，这使得新冠病毒存在一种独特的“复制矫正”机制，用来对转录复制过程中的错配核苷酸进行切除校正，该过程由nsp14的核酸外切酶结构域完成。这种“复制矫正”机制也使得新冠病毒在一定程度上可以逃避瑞德西韦等多种核苷类似物的抑制活性；另一方面，nsp14还具有mRNA加帽第三步——N7-MTase的生理活性[17]。这样在生命周期中存在显著差异的两个过程如何在同一个蛋白中进行协同，也是冠状病毒结构功能研究领域悬而未决的难题之一。

鉴于此，饶子和院士联合攻关团队在前期研究工作的基础上，成功解析了加帽过程的关键复合物cap（0）-RTC与执行“复制矫正”功能的超级复合体冷冻电镜结构[18]。通过结构分析，发现nsp9发挥了类似“适配器”（adaptor）的效应，通过蛋白-蛋白的相互作用，将nsp10和nsp14招募到新形成的复合物中，完成mRNA加帽的第三步反应。另外，cap（0）-RTC可以形成同源二聚体，该二聚体中解旋酶nsp13可以发生显著的构象变化。这种构象变化会引起核酸产物链回溯，将产物链3'末端拉扯到临近一侧的另一分子复合物中核酸外切酶活性中心，并对错配核苷酸进行矫正。这种矫正机制被称为“in trans backtracking”，与真核细胞RNA聚合酶Pol II类似，表明新冠病毒在进化中的高等性。该研究成果不仅揭示了新型冠状病毒复制矫正的结构细节，更为开发阻碍病毒逃逸机制的抑制剂提供结构基础。

3 总结与展望

面对新型冠状病毒，我国科研工作者的丰富成果得益于国内各研究团队在冠状病毒主蛋白酶及转录复制领域中的长期积累。其中，饶子和院士研究团队自2003年“非典”暴发以来，长期坚守在冠状病毒研究领域，是国际冠状病毒研究领域的领军实验室之一。多年的坚守和积累，为此次新冠疫情科技攻关奠定了关键基础，同时电子显微学的进步以及我国基础研究水平的提高，也成为一系列研究在短时间内获得突破的重要条件。未来一段时间，随着工作的深入，针对主蛋白酶和聚合酶两个核心抗病毒药物靶标的药物发现工作对于应对冠状病毒的长期威胁有重要意义，研究过程中发现的一批抑制剂分子和已经陆续进入临床研究阶段的候选药物可能会为疫情的控制发挥重要作用。