MAP3K14下调miR-17-5p对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

曹洪庆 刘广民

胰腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤，胰腺癌的5年生存率为7%～8%，近年来胰腺癌发病率和死亡率逐年上升[1]。因此，对于胰腺癌进行早期诊断，采取积极有效的干预措施阻止胰腺癌的进展是提高患者生存率的关键所在。长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)是长度>200个核苷酸的非编码RNA，没有编码蛋白的功能。研究发现,lncRNA在调节细胞增殖、凋亡、侵袭及血管生成中发挥着重要功能[1]。越来越多的研究表明,lncRNA参与肿瘤细胞的形成和发展。例如,在肺腺癌、前列腺癌、白血病、结肠癌和肝癌组织中均发现lncRNA差异表达[2]。研究发现，lncRNA MALAT1通过靶向调控miR-204表达诱导胰腺癌细胞G2/M细胞周期停滞、促进细胞凋亡,抑制细胞的迁移和侵袭能力[3]。LncRNA-PVT1通过调节miR-448促进胰腺癌细胞的增殖和迁移[4]。LncRNA BCAR4在胰腺癌细胞中表达升高,LncRNA BCAR4的高表达可促进胰腺癌细胞增殖，抑制凋亡[5]。有研究报道lncRNA MAP3K14在胰腺癌组织中下调表达，其可能与胰腺癌的发生发展有关[6]，另外MAP3K14对胰腺癌细胞的生物学行为的影响及具体机制尚不清楚。目前研究已证实丝裂原活化蛋白激酶家族MAPK参与调控肿瘤的发生发展，其中已证明MAP3K10可通过上调gli-1和gli-2的表达促进胰腺癌细胞增殖[7]，MAP3K14可抑制乳腺癌细胞生长和侵袭[8]。因此，本研究就MAP3K14对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响以及是否通过调节miR-17-5p来影响胰腺癌细胞的增殖凋亡进行研究,以期为今后胰腺癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI 1640培养基购自美国 Gibco，胎牛血清购于Gibco，Trizol试剂盒购于TakaRA,lncRNA 提取试剂、荧光定量RT-PCR 试剂盒购于Qiagen,试剂 LipofectamineTM 2000、OTI-MEM均购自Invitrogen。miR-MAP3K14引物合成自上海生工生物公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega，pcDNA3.1、pcDNA3.1-MAP3K14、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p购自武汉淼灵生物科技有限公司，CCK-8试剂购自美国 Amresco 公司。

1.2 标本收集 55例胰腺癌组织及25例癌旁组织标本，来源于医院手术治疗的患者，在手术前均未采用放疗和化疗，术后病理诊断是胰腺癌的肿瘤组织和癌旁正常组织的液氮冻存标本。标本的采集均经过患者同意，签属知情同意书，并经过医院伦理委员会审核通过。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养:采用含有胎牛血清为10%的RPMI1640培养液对Panc-1细胞和MIApaca-2细胞进行培养。使其在温度为37℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱内培养。定期观察，根据细胞生长状态更换培养液。当细胞铺满瓶底80%左右时，加入胰蛋白酶消化传代。

1.3.2 细胞转染及实验分组:收集对数生长期的人胰腺癌Panc-1、MIApaca-2细胞，并以适当密度接种到6孔板上。于细胞培养箱中培养至细胞融合度约为70%，根据LipofectamineTM2000转染试剂使用说明书进行转染，实验分组：Con组(未进行任何处理的细胞)、pcDNA3.1组(空载体转染至细胞)、pcDNA3.1-MAP3K14组(MAP3K14过表达载体pcDNA3.1-MAP3K14转染至细胞)、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC组(pcDNA3.1-MAP3K14与miR-NC共转染至细胞)、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p组(pcDNA3.1-MAP3K14与miR-17-5p mimics共转染至细胞)，转染6 h 更换为含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，继续培养48 h后收集细胞。为验证 MAP3K14对miR-17-5p的靶向调控作用，实验分组：pcDNA3.1组、pcDNA3.1-MAP3K14组、si-NC组(si-NC转染至细胞)、si-MAP3K14组(MAP3K14小干扰RNA转染至细胞)。严格按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行操作。

1.3.3 Real-time PCR 法检测RNA的表达:根据Trizol试剂(Invitrogen)盒说明书方法抽提各试验组总RNA，并测定其浓度。取2 ng 总RNA加入逆转录试剂盒(Invitrogen)转录成cDNA，加80 μl DEPC稀释后，放-20℃保存。用SYBR Green I PCR 检测试剂盒对5 μl cDNA 溶液进行荧光定量PCR，MAP3K14引物序列：上游为5’-ATTTGCTCCTGCTCCTCCAGA-3’，下游为5’-CCAGCCTCCTCCCAGTCTTTC-3’；内参GAPDH引物序列：上游为5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’，下游为5’-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’；PCR反应条件：95℃ 2 min；95℃ 10 s,60℃ 30 s，70℃ 30 s，共40个循环；解链曲线分析：95℃ 1 min，55℃ 30 s；然后缓慢升温至 95℃，升温速率为0.2℃/s。采用2-ΔΔCt法分析目的lncRNA的相对表达水平，上述具体操作依试剂盒说明书进行。后续实验中，miR-17-5p的表达亦采用RT-PCR检测，其中引物分别为miR-17-5p-F：5′-TGTCAAAGTGCTTACAGTG-3′; miR-17-5p-R：5′-CCATAATGCTACAAGTGCC-3′;U6作为内参,U6-F:5’-GCTTCG GCAGCACATATACTAAAAT-3′; U6-R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.3.4 CCK-8检测细胞增殖:取上述对数生长期的各组Panc-1、MIApaca-2细胞，以每孔 2×105个密度种植于96孔细胞板上。培养箱内常规培养，在培养时间截止前2 h加入10 μl CKK-8溶液，放在5% CO2、37℃培养箱中孵育2 h，采用酶标仪检测各孔在490 nm波长处的吸光度值。

1.3.5 平板克隆实验检测细胞克隆数:各组细胞培养48 h后用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于细胞培养板中，于37℃培养箱培养2周，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定15 min，然后去固定液，加适量Giemsa染色10～30 min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。显微镜下计数。

1.3.6 流式细胞术检测细胞的凋亡:转染后48 h的细胞用于实验，消化收集1×104个细胞，加入100 μl PBS和100 μl DNA Prep LPR，孵育10 min后再加1 ml DNA Prep Stain，孵育10 min，流式细胞仪检测细胞周期:收集1×105个细胞，PBS 洗涤后加入5 μl Annexin缓冲液、5 μl 7AAD、5 μl AnnexinV-PE，避光孵育10 min 后上流式细胞仪分析。

1.3.7 双荧光素酶报告基因检测实验:采用starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)靶基因预测库检测到MAP3K14与miR-17-5p存在结合位点。猜测miR-17-5p可能是MAP3K14的一个靶基因。为验证这一猜想，我们构建了野生型WT-MAP3K14和突变型MUT-MAP3K14的荧光素酶报告载体。参照1.3.3中的方法以LipofectamineTM2000将miR-NC、miR-17-5p分别与WT-MAP3K14和MUT-MAP3K14共转染，于细胞培养箱中常规培养48 h。收集各组细胞，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作步骤进行检测。

2 结果

2.1 MAP3K14在胰腺癌组织中相对低表达 与人正常胰腺组织比较，胰腺癌组织中MAP3K14的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 MAP3K14在胰腺癌组织和正常胰腺组织中的表达

2.2 MAP3K14抑制Panc-1、MIAPaCa-2细胞增殖并促进细胞凋亡 pcDNA3.1-MAP3K14组Panc-1、MIApaca-2细胞中MAP3K14的表达水平明显高于pcDNA3.1组(P<0.05)，成功构建了MAP3K14过表达的panc-1、MIApaca-2细胞。转染24 h后，2组细胞的吸光度值差异无统计学意义(P>0.05)，而转染48 h和72 h后，pcDNA3.1-MAP3K14组的吸光度值较pcDNA3.1组明显下降(P<0.05)；与pcDNA3.1组比较，MAP3K14过表达后Panc-1、MIAPaCa-2细胞的凋亡数明显增加(P<0.05)，与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-MAP3K14组Panc-1、MIApaca-2细胞平板克隆数显著降低(P<0.05)。MAP3K14过表达可抑制Panc-1、MIAPaCa-2细胞的增殖、促进细胞的凋亡。见图1，表2～4。

图1 过表达MAP3K14对细胞Panc-1、MIAPaCa-2凋亡的影响

表2 过表达MAP3K14对细胞Panc-1增殖、凋亡的影响

表3 过表达MAP3K14对细胞MIAPaCa-2增殖、凋亡的影响

表4 过表达MAP3K14对细胞Panc-1、MIAPaCa-2平板克隆数的影响

2.3 MAP4K14吸附miR-17-5p，并负向调控其表达 starBase软件检测结果，MAP4K14与miR-17-5p之间存在互补结合位点。双荧光素酶报告基因实验检测结果，同miR-NC与WT-MAP3K14共转染比较，miR-17-5P与WT-MAP3K14共转染后，Panc-1细胞的荧光素酶活性明显降低(P<0.05)；而miR-NC、miR-17-5p分别与MUT-MAP3K14共转染后，Panc-1细胞的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05),可见MAP3K14对miR-17-5p具有靶向作用。与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-MAP3K14组中miR-17-5p表达水平明显降低(P<0.05)；相反，si-MAP3K14组中miR-17-5p表达水平明显高于si-NC组(P<0.05)。MAP3K14可负向调控miR-17-5p表达。见图2，表5、6。

表5 双荧光素酶报告实验

图2 MAP3K14的3’UTR中含有miR-17-5p的互补核苷酸序列

2.4 过表达miR-17-5p能逆转MAP3K14对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响 24 h作用时间下，pcDNA3.1组、pcDNA3.1-MAP3K14组、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC组和pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p组细胞的增殖能力差异无统计学意义(P>0.05)；48 h和72 h作用时间下，pcDNA3.1-MAP3K14组细胞的增殖能力较pcDNA3.1组明显减弱(P<0.05)，pcDNA3.1-MAP3K14组与pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC组间差异无统计学意义(P>0.05)，但pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p组较pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC组明显升高(P<0.05)。同时，pcDNA3.1-MAP3K14组细胞的凋亡率能力明显高于pcDNA3.1组(P<0.05)，pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p组明显低于pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC组(P<0.05)，而pcDNA3.1-MAP3K14组与pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC组间差异无统计学意义(P>0.05)。miR-17-5p过表达可显著逆转MAP3K14对胰腺癌panc-1细胞增殖的抑制作用、逆转对细胞凋亡的促进作用。见表7。

表6 MAP3K14对miR-17-5p表达的影响

表7 过表达miR-17-5p能逆转MAP3K14对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响

3 讨论

胰腺癌的恶性程度非常高，它具有起病隐匿、手术切除率小、预后不良、病死率高、生存率低等特点。目前根本的治疗原则依然是以外科治疗为主，放化疗为辅。手术是唯一可能根治的方法，但因胰腺癌的早期诊断困难，易早期发生侵袭转移，故手术切除率低、预后不良、术后生存率低。放化疗是肿瘤综合治疗中的重要环节，但胰腺癌对化疗药的反应程度不明显，对放疗不敏感，故对于延长晚期胰腺癌患者的生存时间作用有限。

长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)其本身不编码蛋白，但研究发现它们在多种层面实现对基因的调控，将类似功能归纳为转录调控、转录后调控和表观遗传学调控3个主要层面[9]。LncRNA的表达或功能异常与人类众多疾病的发生密切相关,如癌症、阿尔兹海默症、糖尿病等，具体表现为LncRNA在序列、空间结构、表达水平及与结合蛋白相互作用上的异常等。研究发现LncRNA与人类多个肿瘤的发病联系密切，可以在多个水平参与基因表达调控网络的构成，调控肿瘤的发生、发展，并与肿瘤的侵袭、转移及患者预后联系密切[10]，其有望成为潜在的诊断标志物和治疗的靶点。有研究证明，长链非编码RNA MAP3K14在胰腺癌组织中下调表达,MAP3K14属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超级家族，能介导刺激信号从细胞膜传递到细胞核或其他胞内靶点，能够调节细胞的增殖、分化、细胞周期和凋亡等[11]；本研究通过RT-PCR法检测到胰腺癌组织中MAP3K14的表达较正常胰腺组织显著下调，通过过表达胰腺癌细胞中MAP3K14，发现MAP3K14能抑制胰腺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，证实MAP3K14是抑癌基因，但MAP3K14对胰腺癌细胞的生物学行为的具体机制尚不清楚。相关研究发现,lncRNA可以通过稳定某些抑癌基因的mRNA以及蛋白来促进癌细胞的生长发育及转移[12]，且在生物中,lncRNA 和miRNA往往是共同作用的,它们之间可以协同调节,也存在相互调节[13]。有研究发现miR-17-5p为癌基因在胰腺癌细胞中上调表达可促进癌细胞增殖、迁移[14]。miRNA是内源性非编码短链 RNA，在转录后水平调节血管生成及细胞周期、凋亡、侵袭和迁移等肿瘤相关基因的表达，进一步影响肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭[15]，所以我们猜测MAP3K14可能是通过调控miR-17-5p的表达来影响胰腺细胞的增殖、凋亡。我们采用双荧光素酶报告基因实验验证发现miR-17-5p的3’UTR上存在MAP3K14的互补结合序列。通过过表达胰腺癌Panc-1细胞中的MAP3K14，发现 miR-17-5p的表达量相对下降，沉默MAP3K14的表达，miR-17-5p的表达量相对上升，证实MAP3K14可负向调控miR-17-5p的表达，再进一步研究，通过过表达胰腺癌Panc-1细胞中miR-17-5p，发现miR-17-5p可以逆转MAP3K14对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响。表明MAP3K14通过下调miR-17-5p的表达来抑制胰腺癌细胞的增殖、促进细胞凋亡。

胰腺癌的发生发展是一个很复杂的过程，是多因素共同参与、多基因协同作用、综合发展的结果[16]，因此找到有效的诊断新方法是提高胰腺癌治疗效果的关键所在。通过深入研究MAP3K14在胰腺癌发生、发展中的作用，有可能从另一方面揭示胰腺癌的发病机制，为胰腺癌诊断提供新的生物标志物，为胰腺癌的治疗提供新靶点，以期抑制癌症的复发和转移，提高临床疗效。