多重PCR与恒温扩增芯片法在呼吸道病原体中的检测价值

邸红芹 安晓颖 张辉 高艳君 陈宁 刘战地

呼吸道感染是常见多发流行病，具有来源复杂，感染力强，感染发病急，潜伏期短，传播快等特点，严重威胁着人们的健康和生活质量。不同的呼吸道病原体感染，其临床症状极为相似，尤其是在不明原因呼吸道疾病爆发时，有效、快速的鉴别患者感染呼吸道病原体的类型对临床早期诊断和治疗至关重要。传统的呼吸道病原体检测方法主要是细菌培养和血清学检测，由于其操作复杂、检测灵敏度低且检测时间长无法满足快速诊断的要求。近年来分子生物学技术以其高敏感度、高特异度且操作快速简便等优点，已经成为快速诊断呼吸道病原体的首选方法[1-3]，且多重病原体检测系统也越来越普及，博奥生物呼吸道病原菌核酸检测为国内运用较多的呼吸道病原体检测试剂盒，是一种基于恒温扩增微流控芯片技术，利用链置酶(Bst酶)在恒温(65℃)条件下进行反应和实时荧光分析，一步完成对靶基因的扩增和检测，简单易行[4]。本研究采用多重PCR检测体系[5]和恒温芯片法检测呼吸道病原体核酸，比较两种方法对呼吸道病原体的检测效能，评估多重PCR体系在呼吸道病原体诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2017年1月至2017年5月诊断为下呼吸道感染或肺炎的新入院患者，符合以下症状：出现咳嗽、咳痰、痰液粘稠，肺部出现湿啰音并伴有发热或白细胞总数和嗜中性粒细胞比例增高等。共收集合格痰液标本123例，其中男81例，女42例；年龄16～88岁，平均年龄(49.55±6.51)岁。痰合格标准：白细胞数>25/低倍视野且上皮细胞<10/低倍视野，样本量≤0.6 ml，置于样本收集管内，立即保存于4℃冰箱，24 h内检测，未及时检测的样本于-70℃冰箱保存。

1.2 试剂和仪器 Ⅱ级生物安全柜(esco，型号LB2-4B1)；低温高速离心机(艾本德型号5424R)；全自动实时荧光定量PCR仪(美国伯乐，型号CFX96 Deep Well)；全自动核酸提取仪(德国凯杰，型号QIAcube connect)；核酸提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit，德国凯杰生物公司)；恒温扩增芯片核酸分析仪(RTisochip-A，博奥生物)；微量移液器(德国艾本德公司)；呼吸道病原菌核酸检测试剂盒(恒温芯片法，博奥生物，货号302010)。

1.3 菌株来源 呼吸道病原体菌株来源于实验室标准菌株以及本院检验科微生物室分离培养，包括铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，Pae)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，Spn)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，Sau)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，Kpn)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae，Hin)。整个过程按照国家传染性病原体的安全操作规范进行。

1.4 核酸提取 痰液标本采用消化液(4% NaOH溶液)消化15～30 min至痰液呈水样，若消化不完全可适当延长消化时间，采用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen，Germany)，根据试剂盒提取说明书，采用全自动核酸提取仪提取核酸，提取的核酸立即检测，若24 h内能检测置于-20℃冰箱保存，若长期保存需置于-70℃冰箱。

1.5 恒温扩增芯片法检测 采用呼吸道病原菌核酸检测试剂盒(恒温扩增微流控芯片法)，根据说明书配制扩增试剂，体系如下：20 μl检测缓冲液(包含检测引物及酶液等)和36.5 μl呼吸道病原体核酸，涡旋震荡，瞬时离心之后加入检测芯片，上机检测，反应程序如下：37℃ 3 min，65℃ 1 min(采集荧光信号)，扩增45个循环。

1.6 多重PCR检测 参照邸红芹等[5]构建的呼吸道多重PCR扩增体系进行检测，反应体系如下：反应液(Taqman Fast Virus One-step Master Mix，Invitrogen)13.5 μl，各引物/探针(终浓度为0.4 μmol/L)1.5 μl以及10 μl核酸。然后将各反应管按以下程序在实时荧光PCR仪(Roche 480)上进行PCR反应：50℃，15 min(逆转录反应)；95℃，10 min(热启动)；95℃，15 s(变性)，60℃，45 s(退火/延伸，采集荧光信号)，扩增35个循环。

1.7 结果判定 PCR扩增结束后，使用荧光定量PCR仪自带软件进行结果分析，所有阴性样本的信号值都应低于阈值；当Ct值>35时，样本低于检测阈值线，结果判定为呼吸道病原体核酸阴性；当Ct值≤35时，结果判定为呼吸道病原体核酸阳性。恒温扩增芯片法扩增阳性的样品会产生类似实时荧光的“S”形扩增曲线，进一步完成对靶基因的扩增和检测，每张芯片内均设有1个阳性质控和9个阴性质控，采用ROC法计算得到待检病原菌的阳性判断值，通过检测软件自动判读，当检测指标的Tp值≤该指标的阳性判断值且阳性质控和阴性质控均正常时，判读为呼吸道病原体核酸阳性；当检测指标的Tp值>该指标的阳性判断值且阳性质控和阴性质控均正常时，判读为呼吸道病原体核酸阴性。

2 结果

2.1 检测结果判定 PCR扩增结束后，采用机器自带软件进行扩增图片分析，相应的检测通道显示各类呼吸道病原体核酸扩增结果，以流感嗜血杆菌(HIN)核酸扩增检测为例，呈“S”型扩增曲线，阴阳性质控都在控，显示检测有效。见图1。

图1 呼吸道病原体核酸检测扩增曲线；A多重荧光定量PCR法检测流感嗜血杆菌核酸扩增曲线；B恒温芯片法检测流感嗜血杆菌核酸扩增曲线，红色曲线为扩增曲线，另外两条扩增曲线为外质控和阳性对照

2.2 多重荧光定量PCR法性能评估 采用多重荧光定量PCR法和恒温芯片法同时对呼吸道病原体标准菌株(包括铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌)进行检测，以恒温芯片法检测为金标准，结果显示多重荧光定量PCR法各个检测通道无相互干扰，具有很高的一致性和特异性。见表1。

表1 多重荧光定量PCR与恒温芯片法一致性和特异性分析

2.3 临床样本检测结果分析 多重荧光定量PCR法和恒温芯片扩增法同时对123例呼吸道疾病患者痰液标本检测结果显示，恒温芯片法检出阳性率为43.09(53/123)，多重荧光定量PCR法检出阳性率为47.15%(58/123)，差异无统计学意义(χ2=0.410，P=0.522)。多重荧光定量PCR法与恒温芯片法对常见呼吸道病原体如：铜绿假单胞菌(χ2=0.200，P=0.655)、肺炎链球菌(χ2=0.063，P=0.802)、金黄色葡萄球菌(χ2=0.063，P=0.802)、肺炎克雷伯菌(χ2=0.048，P=0.827)、结核分枝杆菌(χ2=0.478，P=0.689)、流感嗜血杆菌(χ2=0.185，P=0.667)的检测结果显示，多重荧光定量PCR法和恒温芯片扩增法的检出率差异无统计学意义(P>0.05)。一致性分析显示多重荧光定量PCR法和恒温芯片扩增法对常见呼吸道病原体检测，包括：铜绿假单胞菌(Kappa=0.900)、肺炎链球菌(Kappa=937)、金黄色葡萄球菌(Kappa=0.937)、肺炎克雷伯菌(Kappa=0.952)、结核分枝杆菌(Kappa=0.854)及流感嗜血杆菌(Kappa=0.908)均具有高度一致性(Kappa均>0.75)。见表2。

表2 多重荧光定量PCR与恒温芯片法对呼吸道病原体检出比较

3 讨论

引起呼吸道感染的病原体种类多且症状大多相似，临床医生很难准确诊断病因，因此，快速、准确检测出患者所感染的呼吸道病原体尤为重要。近年，适用于检测病原体的分子生物学技术不断涌现，核酸检测技术由于其高敏感性、便捷性和简便性，越来越多的用于临床实验室呼吸道病原体的常规诊断，如荧光定量PCR[6-8]、恒温扩增技术[9-12]以及芯片技术[13-15]、测序技术[16-18]等。呼吸道病原体的高通量检测也越来越普及，其中比较常用的有多重荧定量PCR法、恒温微流控芯片法以及测序法。徐嘉楠等[19]运用多重PCR技术联合熔解曲线(Tm)快速检测并区分22种呼吸道感染相关的病原体，结果显示这种基于多重PCR技术的检测试剂盒不仅极大缩短检测时间，得到较高的阳性率，且其操作技术也较常规方法更简便；李艳燕等[20]采用基于环介导等温扩增技术(LAMP)结合微流控芯片，进行13种常见下呼吸道病原体检测，该方法简单快速、试剂耗量低、自动化程度高，提高了检测敏感性，具备了对呼吸道感染性疾病的快速诊断能力，极大缩短了检验周期。吕园等[21]对13种呼吸道病原体多重检测试剂(PCR毛细管电泳片段分析方法)进行性能验证，证实该试剂盒满足交叉反应、符合率及抗干扰能力等要求，可用于临床呼吸道样本的检测。可见核酸检测技术的应用将成为广谱呼吸道病原体检测的新方向。

本研究将多重PCR与荧光定量PCR相结合建立多重荧光定量PCR(MRT-PCR)体系，针对呼吸道病原体核酸序列的保守区设计特异性引物和荧光探针，同时综合两种检测方法的优点能够快速、高通量的检测常见的呼吸道病原体[5]。以恒温芯片法为参照[22，23]，一致性分析显示多重荧光定量PCR体系间各检测通道干扰，具有很高的特异性(表1)。同时，对123例呼吸道疾病患者痰液标本检测结果显示，恒温芯片法检出阳性率为43.09%(53/123)，多重荧光定量PCR法检出阳性率为47.15%(58/123)，差异无统计学意义(χ2=0.410，P=0.522)，显示多重荧光定量PCR可用于呼吸道病原体的检测。

本研究对两种方法的操作简便性和时效性进行比较，两种方法样本处理及核酸提取的过程相同，结果判读都是根据Ct值。恒温芯片检测试剂盒一次能同时检测13种病原体，但每次只能检测1个样本；多重荧光定量PCR法一次能同时检测15种病原体，每次检测量依据PCR仪的通量而定，每份样本需要1个八联排PCR管。操作步骤方面，恒温芯片检测试剂盒操作较简便，仅需一步操作即可完成；而多重荧光定量PCR需要配置多个试剂盒，需要手工操作的步骤比较多。仪器要求方面，恒温芯片检测试剂盒完成所有病原体的检测需要相应的恒温检测仪，1 h以内即可完成，但如果需要同时检测多个样本，则需要增加仪器的数量；多重荧光定量PCR法需要PCR仪，2.5～3 h完成检测，仪器越多或通量越大检测样本数量越多。因此，在实际应用中，可根据实际情况来选择合适的检测方法。

本研究将与恒温芯法检测试剂盒共有的7种常见呼吸病原体：铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌进行检测性能分析。多重荧光定量PCR法和恒温芯片法对铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌的阳性检出分别为12例(9.76%)、9例(7.32%)、8例(6.50%)、11例(8.94%)、22例(17.89%)、11例(8.94%)和10例(8.13%)、8例(6.50%)、9例(7.32%)、12例(9.76)、18例(14.63%)、13例(10.57%)，同时对阳性检出进行统计学分析，差异无统计学意义(P>0.05)，一致性分析Kappa值显示两种检测方法具有高度一致性(Kappa>0.75)。本研究因未评估多重荧光定量PCR体系中其他病原体如流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒以及冠状病毒的检测性能，具有一定的局限性，同时增加样本量并应采用更多相似的商品化检测试剂盒进行进一步地性能验证。

综上所述，构建多重荧光定量PCR体系与恒温芯片检测法对常见呼吸道病原体的检测敏感性和特异性相近，可用于快速、高通量筛查多种呼吸道病原体，具有良好的应用前景。