PP2A调节mbk-2影响秀丽隐杆线虫胚胎发育

翟佳佳 康平

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C.elegans)结构简单、生长周期短、基因与人类基因具有高度同源性、易培养，是研究遗传、基因组和分子网络的重要模式。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)属于丝/苏氨酸磷酸酶，在调节细胞关键功能，如细胞周期、发育、代谢和凋亡中发挥重要作用。mbk-2是秀丽隐杆线虫双特异性Yak-1相关激酶家族中的两种丝氨酸/苏氨酸激酶之一。mbk-2在早期胚胎发育，特别是在单细胞胚胎的多个微管依赖过程中起重要作用，包括原核迁移、纺锤体定位、微管稳定性和染色体分离[1]。大规模线虫RNAi筛选发现，增强子pptr-1、pptr-2对mbk-2有调节作用。pptr-1和pptr-2可编码PP2A的调节亚单位，对调节PP2A功能发挥重要作用。本研究采用秀丽隐杆线虫mbk-2突变体观察PP2A调节亚单位pptr-1和pptr-2对mbk-2的调控作用，为进一步研究mbk-2在胚胎发育中的作用及调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 线虫株系与菌株 野生型线虫N2、mbk-2基因敲除型线虫株系、大肠埃希菌OP50 购自美国秀丽线虫遗传中心(Caenorhabditis Genetics Center)。

1.2 主要仪器及试剂 氨苄青霉素(上海BBI，A610028);羧苄青霉素(美国Sigma，A6140);L4440质粒(美国Addgene)。体式解剖显微镜(厦门Motic)；低温高速离心机(德国eppendorf)；激光共聚焦成像系统(德国Leica)。

1.3 实验方法

1.3.1 线虫生长培养:线虫培养采用NGM培养基，称取NaCl 3 g，琼脂20 g，蛋白胨2.5 g，溶于975 ml双蒸水，高压灭菌。冷却后，加入1 mol/L CaCl21 ml，5 mg/ml胆固醇1 ml，1 mol/L MgSO41 ml和1 mol/L KPO4缓冲液25 ml，混匀后导入细菌培养皿中。室温放置2 d后，铺上OP 50菌，室温放置2 d后即可培养线虫。

1.3.2 线虫同步化:将线虫常规培养在NGM培养基上，20℃生化培养箱中生长繁殖。用Bleach裂解液冲洗NGM培养基，震荡，低速离心，吸取上清液，再加入S-basal溶液，震荡，离心，吸取上清。重复2次加入后加入S-buffer溶液放进入25℃生化恒温箱中培养过夜。第2天离心，吸取上清，将剩余部分混匀后，涂抹在NGM培养基上．待NGM培养基中的线虫进入产卵期，将正处于产卵期的线虫(母虫)挑到NGM培养基上进行产卵。2～3 h后将线虫(母虫)挑走杀死后，将NGM培养基放进25℃的生化培养箱中进行培养。第二天观察存活情况，发育至成虫(L4期)后可用来进行相关实验。

1.3.3 RNAi干扰试验:RNAi细菌在含有50 g/L氨苄青霉素的LB溶液中于37℃振荡过夜。将细菌溶液点在NGM琼脂平板上(含有100 g/L氨苄青霉素、12.5 g/L四环素和1 mmol/L IPTG)，并在室温下诱导细菌过夜。在20℃条件下，将同步化好的N2及mbk-2基因缺陷线虫在NGM培养基中培养至L4期，喂食RNAi细菌，分别含有沉默pprt-1和pprt-2基因的质粒(沉默组)和L4440空载质粒(对照组)。

1.3.4 孵化率测定:将大约50只线虫放在装有300 μl 细菌的RNAi平板上，并对它们进行培养，直到它们长到L4期。然后将线虫转移到装有30 μl RNAi细菌的新鲜琼脂培养平板(每块平板上有三只蠕虫)，并将其孵育24 h。然后这些线虫(新的成虫)被转移到另一个RNAi平板上，24 h后移除。将平板上的子代培养24 h后，我们对幼虫和未孵化的虫卵数量进行计数。

1.3.5 幼虫发育分析:线虫从L1阶段喂食RNAi细菌，直到线虫成年产卵前两天。预先准备约0.4 mm厚的琼脂垫，并在使用前与M9溶液和盖玻片一起放入温控培养箱中孵育2 h。在盖玻片上滴加的2 μl M9缓冲液，并在其中解剖8～10个只成虫，用熔化的凡士林封片，显微镜下观察并拍照记录。

2 结果

2.1 pprt基因沉默对N2线虫孵化的影响 采用含pprt-1和pprt-2的RNAi细菌喂养线虫，观察抑制pprt对线虫孵化率的影响，对照组采用含L4440质粒的细菌喂养。结果显示，抑制pptr-1后，线虫无虫卵死亡，所有虫卵均孵化出幼虫。而抑制pprt-2后，(39.7±1.53)的虫卵死亡，其未孵化率为(5.83±0.23%)，显著高于对照组N2和pprt-1干预组。见表1，图1。

2.2 pprt-1和pprt-2基因沉默对mbk-2突变线虫孵化的影响 采用pprt-1和pprt-2的RNAi细菌喂养mbk-2突变型线虫。结果显示，L4440质粒喂养的N2对照组线虫，无虫卵死亡，与N2组相比，mbk-2突变会增加虫卵的未孵化率，在(1.63±0.51%)。采用RNAi抑制pprt-1后，虫卵死亡增加，未孵化率(3.73±0.12%)，显著高于N2对照组和pprt-1 RNAi处理组。抑制pprt-2后，线虫虫卵的未孵化率达到(76.74±1.62%)，显著高于N2对照组，mbk-2组，mbk-2+pprt-1处理组以及pprt-1RNAi处理组。见表1，图1。

表1 线虫虫卵孵化率统计表

图1 线虫虫卵孵化检测

2.3 pprt-2基因沉默对mbk-2突变线虫胚胎发育的影响 为研究pprt-2对mbk-2的调控作用，采用pprt-2 RNAi细菌喂养mbk-2突变线虫。对胚胎发育表型的研究显示，在单细胞阶段，pprt-2 RNAi干预对胚胎发育不产生影响，原核迁移、纺锤体的建立和假裂沟的位置正常。而在双细胞阶段，则表现为明显缺陷。AB和P1细胞的大小相差很大；当与野生型相比时，AB细胞比P1细胞大得多，和/或在AB细胞和P1细胞中都可以看到多个细胞核。我们还观察到没有细胞核或细胞体的额外细胞的存在，这些细胞在许多情况下与其他细胞分离，然后融合回来。AB和P1纺锤体可能已经消失，或者其中一个丢失，或者它们可能有定向缺陷。在一些胚胎中，P1细胞首先分裂，或者AB和P1同时分裂(四极分裂)。其他胚胎表现出极端的胞质分裂缺陷，其中细胞之间或异常的细胞-细胞接触之间没有明显的边界。或者，当4个单元可以区分时，它们的大小可能有很大的不同，4个细胞有多个细胞核。大多数观察到的缺陷类似于mbk-2功能的强烈丧失，表明pptr-2影响胚胎此阶段的发育需要mbk-2参与。这种相互作用独有的一种表型是P1细胞分裂的延迟。在ABa和ABp细胞的细胞核形成之后，就在这些细胞分裂之前，P1纺锤体仍然没有建立。在相同条件下的两个细胞阶段，具有pptr-2对照的N2也显示出野生型发育，这意味着所观察到的缺陷不仅是pptr-2功能降低的产物，并且具有L4440对照胚胎的mbk-2除了存在胞质体之外大多是正常的，胞质体是没有细胞核的额外空细胞。见表2，图2。

表2 线虫胚胎发育表型检测

图2 胚胎发育表型观察

3 讨论

对mbk-2(dd5)修饰物的大规模RNAi筛选中，发现了四种增强子(rsa-1、pptr-1、pptr-2和rsa-2)。rsa-1、pptr-1、pptr-2均编码PP2A的调节亚单位，rsa-2与rsa-1形成复合物[1]。PP2A参与许多重要的细胞功能，包括细胞移动性[2]、细胞骨架动力学[3]、细胞周期控制[4]、细胞生长控制、细胞增殖、细胞死亡[5]、信号通路和肿瘤抑制[6]。核心PP2A酶由支架亚单位A和催化亚单位C组成，两者都是高度保守的[7]。PP2A底物特异性是由几个调节亚单位之一赋予的，它与核心酶相互作用形成全酶[2]。这些调节亚单位分为四个家族:B (B55或PR55)、B (B56或PR61)、B (PR48/PR72/PR130)和B (PR93/PR110)[2]。在秀丽隐杆线虫中，已经通过矫形学鉴定了7个PP2A调节亚单位:sur-6，B家族；pptr-1和pptr-2，B族；F47B8.3，C06G1.5，rsa-1和T22D1.5，B族[8]。

PP2A调节亚单位PPTR-1是有丝分裂期间P-颗粒的稳定性和不对称分布所必需的[9]。在胚胎的前四个分裂阶段，P颗粒的不对称分布对于确定种系和区分种系与体细胞前体是很重要的。有丝分裂后，P颗粒在种系前体中保持稳定，但在体细胞胚粒中，P颗粒蛋白逐渐降解，P颗粒核糖核酸迅速降解[9]。PPTR-1特别适用于磷颗粒的分离，但不适用于分离PAR-1/2、MEX-5。这些种质成分从磷颗粒中自由分离。在pptr-1突变胚胎中，P颗粒和核糖核酸被平均分配到体细胞和种系卵裂球，但在这些细胞类型中表现不同。在体细胞胚中，P颗粒RNA迅速消失，P颗粒在2个细胞周期后聚集成颗粒，在原肠胚形成后消失。在种系卵裂球中，P颗粒稳定并重新组装成颗粒；只是每个部门的规模和数量都减少了[9]。本研究显示，在单独抑制线虫pprt-1表达后，对虫卵的孵化率并无影响，而联合抑制pprt-1和mbk-2后，虫卵的未孵化数量增加，提示pprt-1通过调剂mbk-2发挥对发育的调节作用。

PPTR-1还通过PP2A调节秀丽新杆线虫胰岛素/IGF-1信号传导(IIS)途径，在幼虫发育过程中的寿命调节、达乌尔滞育、代谢和应激反应中发挥重要作用[8]。IIS在生命周期和dauer滞育控制中是必不可少的，并且涉及由几个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶介导的磷酸化级联。激酶将信号传递给胰岛素样受体DAF-2以激活PDK-1激酶，后者将信号传递给AKT-1、AKT-2和SGK-1[10,11]。这些激酶负调节叉头转录因子-16[12]。需要PP2A活性来平衡这些激酶在胰岛素抵抗途径中的作用。PPTR-1直接抑制AKT-1的功能，这积极地促进了DAF-16的核定位和活动[8]。叉头转录因子DAF-16激活与寿命、应激抗性、达斡尔族形成和脂肪储存有关的基因转录[8]。

本研究的实验结果表明pptr-2是调节mbk-2功能的最强的增强子。mbk-2的两个主要功能是控制微管依赖过程和调节种系决定因素。为了研究由参与相互作用的两个基因的功能丧失所产生的亚细胞表型，着重研究了pptr-2的作用。结果显示，不论是单独抑制pprt-2，或联合抑制pprt-2和mbk-2，线虫虫卵的未孵化水平均显著升高。特别是联合抑制，虫卵的未孵化率可达到76.745，提示pprt-2是调控mbk-2功能的主要增强子。从DIC结果来看，mbk-2和pptr-2的相互作用在单细胞阶段没有表现出明显的缺陷，这意味着这种相互作用在单细胞阶段没有影响原核的迁移、纺锤体的建立或假分裂的位置。在两细胞阶段，mbk-2和pptr-2相互作用涉及显示强烈缺陷的胚胎，这与mbk-2功能的丧失非常相似。例如:极体出现在后部，多核，胞质存在，纺锤体和胞质分裂缺陷。这些可能表明pptr-2增强子与mbk-2在相同的过程中起作用，这可能是与后验决定子分布相同的过程。P-颗粒、OMA-1、PIE-1、POS-1和其他后向决定因素的分布需要mbk-2[13]。第一次细胞分裂后，mbk-2磷酸化OMA-1使其降解。通过将MEX-5/6分布到前部，mbk-2不对称地定位了P-颗粒、PIE-1和位置-1[9,14]。因为PPTR-1和PPTR-2在PP2A的相同亚基调节家族中。PPTR-1对有丝分裂过程中P颗粒的稳定性和不对称分布很重要[9,14]。PPTR-2也可能影响P颗粒和其他后决定因素。交互排斥表型，P1细胞的分裂比野生型延迟得多。这种表型先前被描述为在DNA检查点途径中基因功能的丧失。这可能预示着mbk-2和pptr-2对于该途径是重要的，并且是P1细胞分裂时间所必需的。