液体活检在头颈部肿瘤诊治中的应用进展

孙岚

孙岚，男，1981 年出生，安徽舒城人，医学博士，主任医师，海归高层次人才，美国南加州大学Keck 临床医学院博士后，重庆市璧山区人民医院肿瘤科主任，带领科室先后获得“重庆市癌痛治疗规范化示范病房”、“重庆市临床重点专科”、“重庆市区域医学重点学科”、“重庆市肿瘤防治十强金牌科室”等荣誉。主研国家级、省部级科研项目9 项，美国NIH 项目2 项，累计发表国内外期刊论文40 余篇，以第一、通信作者发表SCI 论文20 余篇。现任重庆医科大学硕士生导师、《重庆医学》编委、重庆市医学会肿瘤青年委员会主任委员、重庆市中西医结合学会放疗专业委员会副主任委员等学术职务，担任国内外多家杂志社特邀编委或审稿专家。

头颈部肿瘤泛指发生在咽、喉、鼻、唾液腺、口腔等部位的恶性肿瘤。一般根据其发生的部位命名，包括喉癌、下咽癌、口咽癌、鼻咽癌、鼻腔和副鼻窦癌、唾液腺肿瘤等。超过90%的头颈部肿瘤属于鳞状细胞癌，始于扁平的鳞状细胞[1]。值得注意的是，有些恶性肿瘤虽然也可发生于头颈部（如脑瘤、食管癌、甲状旁腺癌、肉瘤、甲状腺癌等），但是诊断和治疗却有很大不同。头颈部肿瘤的主要危险因素包括吸烟、饮酒、人乳头瘤病毒（HPV）和Epstein-Barr（EB）病毒感染，长期暴露于这些致癌因素，可导致口咽黏膜发育不良、癌前病变和癌变。头颈部肿瘤是一种全球性的恶性肿瘤，在美国，去年大约有53 260 例新发患者，有10 750 例患者死于该病[2]。患者确诊时多是中晚期，只有不到三分之一的头颈部肿瘤患者可以在早期发现。因此，早期检测和实时监测对头颈部肿瘤的诊治至关重要。

1 液体活检

液体活检是对生物体液的信息检测技术的统称，包括液体DNA、液体RNA、循环肿瘤细胞（circulation tumor cells，CTCs）等的检测。由于组织活检难以捕获转移性肿瘤的分子多样性和持续演变情况，因此随着非侵入性诊断工具的发展，液体活检已经成为了实时监测肿瘤状态变化的重要手段。在头颈部肿瘤中，血液和唾液是液体活检最常用的样本来源[3]。液体活检可弥补影像学的不足，在肿瘤发生、发展的不同阶段提供肿瘤转移的分子信息，从而评估患者的实时疗效和预后情况，是一种有前途的恶性肿瘤诊断工具[4-5]。

1.1 头颈部肿瘤中的液体DNA 检测 在头颈部肿瘤中，液体DNA 检测是最常用的一种液体活检，包括循环肿瘤DNA（circulation tumor DNA，ctDNA）、微卫星改变、拷贝数畸变、甲基化水平检测等[6-7]。肿瘤DNA 片段会不断地从肿瘤原发灶和转移灶中脱落，因此可以在血液或其他体液中检测到ctDNA。肿瘤和非肿瘤细胞都会分解释放DNA 到循环系统形成cfDNA（cell-free DNA），癌症特异性基因组的改变可以将两者区分开，另一个区分因素是DNA 片段碱基对长度的差异，细胞凋亡产生约100～200 bp 的DNA 片段，而坏死通常会产生更大的DNA 片段[8]。cfDNA 中包含了ctDNA，长度在180～200 个碱基对之间[9-11]。已有研究证明一些实体瘤患者的血浆ctDNA 和匹配的肿瘤样本突变图谱高度一致[4]。在大多数实体瘤患者的液体DNA 活检中，ctDNA 只占很小的比例，通常不到1%，而随着肿瘤负荷的增加，其占总cfDNA 的比例也会逐渐增加[10，12]。一项研究在检测了乳腺癌、直肠癌、胃癌以及胰腺癌患者的血浆ctDNA 后，发现总体ctDNA 在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期时的检出率分别为55%、69%、82%，另外，47%的Ⅰ期癌症患者可以检测出ctDNA[13]，但ctDNA 水平并不能完全反映出头颈部肿瘤的实际肿瘤负荷，譬如由于肿瘤快速生长可致自身坏死和体积收缩，从而导致ctDNA 水平升高[14]。此外，唾液DNA 检测有可能对评估头颈部肿瘤的疾病状态以及循环肿瘤DNA 变化提供重要帮助[15]，对于口咽癌、下咽癌和喉癌，血浆ctDNA 比唾液ctDNA 敏感性更高，而唾液ctDNA 在口腔癌中表现出比血浆ctDNA 更高的敏感性[4]。有研究表明，唾液中的肿瘤DNA 水平显示了晚期HPV 相关性口咽癌的病变状态，并与肿瘤负荷密切相关[16]。对于头颈肿瘤患者，唾液中的肿瘤DNA 检测预测了疾病的早期转移征兆[17]。在头颈部肿瘤的动物模型中，唾液肿瘤DNA 比血浆ctDNA 更能反映肿瘤的转移和复发[18]，有一项针对47 例头颈部鳞癌患者的研究，在检测了9 例患者术后治疗样本后，发现3 例复发患者的ctDNA 出现要早于临床/影像学证据，并对5 例ctDNA阴性患者进行了12 个月的随访，发现均无复发[19]。

此外，头颈部肿瘤的液体DNA 检测不仅包括肿瘤特异性突变位点的检测，还包括肿瘤相关病毒DNA 的检测。除了血浆EB 病毒DNA 用于早期鼻咽肿瘤筛查外[20-21]，HPV 的DNA 检测对HPV 阳性的头颈部鳞癌早筛和监测都具有很高的诊断价值[22]。在97 例非转移性的局限型口咽鳞癌患者中，90 例检出HPV16-ctDNA，3例检出HPV33-ctDNA，总灵敏度为95.6%[23]。

1.2 头颈部肿瘤中的液体RNA 及外泌体检测 miRNAs 是一种小的非编码调控RNA，其表达改变可以作为潜在的肿瘤生物标志物。口腔鳞癌进展过程中，血浆miRNA 谱发生改变，miR-486-5p、miR-375 和miR-92b-3p 的下调与肿瘤复发密切相关，可用于监测术后复发[24]。长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）在头颈部肿瘤也有异常表达，在接受根治性放化疗的头颈部肿瘤患者中，循环GAS5 可作为预测疗效的生物标志物[25]。外泌体是一种直径约为30～200 nm 的小膜泡，存在于血液、唾液等体液中，由肿瘤细胞和非肿瘤细胞产生和释放，含有蛋白质、脂类、miRNA、lncRNA等，具有来自亲代细胞的丰富信息。肿瘤源性的外泌体参与了头颈部肿瘤的发生、侵袭、发展、免疫调节、治疗应用和耐药等方面[26]。但目前在头颈部肿瘤中外泌体研

究不多，作用机制尚不清楚，需要进一步的研究。

1.3 头颈部肿瘤中的CTCs 检测 CTCs 是从肿瘤原发灶或转移灶中脱落进入血管系统并不断循环的游离肿瘤细胞，蕴含了肿瘤分子表型和病理特征的丰富信息。现在的临床分期诊断技术并不能有效检测那些不可见的亚临床病灶，包括头颈部肿瘤在内的实体瘤患者外周血中CTCs 检测已被证明对于判断亚临床病灶具有明显优势[27-28]。目前，CTCs 在乳腺癌等各种实体瘤的诊断分期、疗效评估和预后判断等研究中都得到较肯定的研究数据，但是，其在头颈部肿瘤中的检测灵敏度一直较低，临床应用受限[29-30]。到目前为止，CTCs 在血液中浓度过低是影响其在头颈部肿瘤应用的主要因素[31]，通过细胞富集优化系统可以提高其检出率，如基于微流控技术的CTCs 免疫捕获技术，有54%的头颈部肿瘤患者可检测到CTCs[32-33]。技术改良的CTCs 检测可作为判断头颈部肿瘤疾病进展风险的重要手段[34]，有报道32 例头颈部肿瘤患者中，有29 例（90.6%）可通过配备精密微过滤器的低压过滤系统检测到CTCs[35]。此外，由于白细胞与CTCs 大小和特征重叠，白细胞污染几乎无法避免，是头颈部肿瘤CTCs 应用的另一个障碍[36]。在头颈部肿瘤的研究中，CTCs 阳性的患者比CTCs 阴性的患者预后更差，可作为疾病预后判断指标[37]。据报道，CTCs 状态与头颈部肿瘤患者的临床特征有密切联系，CTCs 阳性与治疗耐药、局部复发和较短的无进展生存期显著相关[36]。一项前瞻性研究显示，在复发的非手术或转移性头颈部肿瘤患者中，CTCs 可以实时监测化疗的早期反应[38]。在鼻咽癌中，52.6%的患者可检测出外周血CTCs，在放疗后1 个月，CTCs 数目明显减少[39]。循环肿瘤微栓子（circulation tumor micromboli，CTM）是指多个CTCs 同类聚集或与其它种类细胞聚集形成的细胞团，一项研究显示在13 例CTC 阳性的头颈部肿瘤患者中有7 例检测出CTM 阳性，与CTCs 阳性的患者相比，CTM 阳性的头颈肿瘤患者预后更差[34，40]。

2 展望

对于恶性肿瘤而言，控制肿瘤的侵袭转移，特别是隐匿性转移灶的早期发现，至关重要。因此，液体活检无疑是一个很有前途的工具，现有数据已经初步印证了液体活检可以从液体DNA、液体RNA、CTCs 等多个层面，对头颈部肿瘤进行多阶段实时病情监测、评估疗效或判断预后。但是，针对头颈部肿瘤的液体活检研究尚不多，现有研究基本存在病例数少、没有大宗临床研究验证等问题，期待将来有更多更有力的循证医学证据。总之，随着精准医学的不断进步，液体活检已展现出越来越强大的技术优势，将在头颈部肿瘤的诊治中扮演越来越重要的角色。