响应面优化超高效液相色谱-串联质谱法同时测定有机肥中14 种磺胺类抗生素

钱诗颖， 蓝雅琼， 刘 倩， 司文帅， 孙明星， 王鲁梅， 沈国清

（1. 上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2. 上海海关工业品与原材料检测技术中心，上海 200135；3. 上海市农业研究院，上海 201403）

磺胺类抗生素（Sulfonamide,SAs）是一类人工合成的广谱抗菌药物，因其成本低廉，且具有较高稳定性及较强亲水性的特性，常被用作饲料添加剂以预防、治疗动物疾病，是我国目前生产、使用量最大的抗生素种类之一[1-2]。SAs 在动物肠道内吸附能力较差，大部分以原药形态随动物粪便和尿液排出体外[3]，并随之以主要原料为禽畜粪便的有机肥进入农田土壤中，在土壤表层累积或随径流进入地表水和地下水[4]。残留的SAs 在环境中的稳定性较好，易被植物吸收富集，并可导致病原菌的耐药性增强，食用动物产生抗生素抗性基因(ARGs)[5-7]。因此，近年来有机肥中抗生素检测越来越受到关注。

有机肥料的基质非常复杂，目标抗生素不易分离提取出来，因此样品的前处理过程十分重要。目前常用的提取技术有固液振荡提取法、超声提取法和加压溶剂萃取法等，其中，固液振荡提取法因具有设备简单、操作方便等优点而被广泛使用。然而，在使用振荡法进行提取过程中，提取溶剂和缓冲液的pH、体积、振荡时间等因素对提取效果影响很大[8-10]，需要对提取条件进行优化。传统的前处理优化方式只反映单个因素的影响，难以分析自变量之间的相互作用，且实验繁琐，效率低[11-12]。响应面分析法（RSM）是一种通过实验设计、数学建模来预测最优工艺参数的研究方法，相对于传统的实验方法，具有计算简便、实验量少等优点，因此广泛应用于环境、制药与化工等领域[13-14]。

本文针对目前畜禽业常用的磺胺吡啶、磺胺哒嗪等14 种磺胺类抗生素，采用溶剂提取法，结合固相萃取净化，利用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLCMS/MS）进行测定，并通过响应面优化法确定振荡时间、缓冲液pH 和缓冲液体积这三个实验因素的最优条件，建立了一种灵敏、高效的测定商品有机肥中14 种磺胺类抗生素残留的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

ACQUITY UPLC XEVO TQ-S 超高效液相色谱串联质谱仪（美国Waters 公司）；HY-5A 型回旋振荡器（常州翔天实验仪器厂）；DT5-2B 型低速台式离心机（北京时代北利离心机公司）；Organomation NEVAP112型氮吹仪（北京成萌伟业公司）；500G 型涡旋混合器（上海安谱实验科技公司）。

1.2 试剂与材料

甲醇、乙腈（ACN）：色谱纯，德国默克公司；甲酸（FA）、柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、乙酸（HAc）、磷酸、三乙胺、氨水，均为分析纯，上海化学试剂有限公司。

磺胺吡啶(SPD）、磺胺哒嗪(SDZ)、磺胺甲恶唑(SMX)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺甲基嘧啶(SMI)、磺胺二甲异恶唑(SIZ)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺-6-氧嘧啶(SMM)、磺胺对甲氧嘧啶(SM)、磺胺甲氧哒嗪(SMPZ)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDO)、磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)，均购于Sigma Aldrich（德国），纯度≥95%。

Waters BEH C18 色谱柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)（美国Waters 公司）；GPD PURIFY MCX 固相萃取柱（北京市广普达科技公司）。

1.3 溶液的配制

标准贮备液：称取各类抗生素标准物质，用甲醇配制成1000mg/L 的溶液。

混合标准溶液：取上述标准贮备液，用甲醇稀释成1 mg/L，−20 ℃下避光密封保存。

标准工作溶液：用φ=50%甲醇溶液稀释混合标准溶液，现配现用。

分析定容液：取5.5 mL 磷酸、6.2 mL 三乙胺和150 mL 乙腈，用水稀释定容到1000mL。

1.4 前处理的优化

1.4.1 前处理 样品采集与制备：样品来源于上海农资市场出售的商品有机肥。取样品真空冷冻干燥48 h后研磨并过0.35 mm 孔径网筛，将样品储存在棕色瓶中，4 ℃条件下避光保存。

通过查阅文献[15]，初步确定肥料样品的前处理方案为：取(2.0 ± 0.02) g 肥料试样于50 mL 聚丙烯离心管中，加100 μL、1 mg/L 混合标准溶液混匀，加入一定体积（5 、10 、15 mL）的乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）-Mcllvaine 缓冲液（pH 为3.0、4.0、5.0），涡动混匀，再加入20 mL、乙腈与乙酸的混合液（V(ACN)∶V(HAc)=80∶20），涡动2 min，在振荡器上振摇一定时间（20、30、40 min）。在4000r/min 下离心10 min 后吸取2.5 mL 上清液，加入10 mL 纯水进行稀释，混匀后待净化。使用GPD PURIFY MCX固相萃取柱进行净化，分别用5 mL 甲醇和5 mL、50 mmol/L 柠檬酸溶液对萃取小柱进行活化，然后将待净化液过柱，弃去滤液，随后用3 mL 纯水和3 mL甲醇溶液淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，最后用3 mL、φ=50%氨化甲醇溶液洗脱，并收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干，用1 mL 分析定容液溶解，过0.22 μm 滤膜后上机待测定。

1.4.2 提取溶剂的选择 乙腈作为提取溶剂可以减少抗生素与有机肥基质中无机元素和有机质的螯合作用，减少基质干扰[16]。同时，提取溶剂的酸化也有利于抗生素的提取[17]。因此，选择乙腈、乙腈与乙酸混合液（V（ACN）∶V（HAc）分别为95∶5，90∶10，85∶15，80∶20）和乙腈、乙酸、水的混合液（V（ACN）∶V（H2O）∶V（FA）=800∶199∶1）6 种提取溶剂，研究比较其对有机肥中抗生素的提取回收率。

1.4.3 响应面优化 选取缓冲液体积（X1）、缓冲液pH值（X2）以及振荡时间（X3）作为响应面实验中待优化的因素，以平均提取回收率（Y）为预测的响应值。实验利用Design-expert 8.0 软件，选择Box-Behnken Design（BBD）实验设计方法设计优化实验，实验因素及水平编码如表1 所示，最后共得到17 个实验方案。

表1实验因素及水平编码Table1Experimental factors and horizontal coding

使用该软件进行拟合、方差分析及最优条件的预测。二次多项式的表达式如下：

式中：Y 表示响应的预测值，即平均提取回收率（%）；A0表示常数；Ai为线性项系数；Aii为二次项系数；Aij为交互项系数；ɛ表示残差；Xi和Xj为各因素水平的编码值（i=1～3，j=1～3）。

1.5 检测条件

1.5.1 色谱条件[18]色谱柱柱温：35 ℃；进样体积：3 μL；流动相：甲醇和10 mmol/L 乙酸铵−0.1%（体积分数）甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～4.0 min，甲醇10%～30%（体积分数，下同）；4.0～5.0 min，甲醇30%～50%；5.0～5.2 min，甲醇50%；5.2～5.5 min，甲醇50%～10%；5.5 min～7.0 min，甲醇10%；流速：0.4 mL/min，柱温：35 ℃。

1.5.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：3.0 kV；源温：150 ℃；脱溶剂温度：550 ℃；脱溶剂气流速：1000L/h；碰撞气流速：0.17 mL/min；14 种磺胺类抗生素的母离子(Parent ion)、定量/定性离子(Daughter ion)及相应碰撞能量(Collision energy)、锥孔电压(Cone voltage)见表2。

1.5.3 线性范围和方法检出限 配制质量浓度为10、20、50、100、200 μg/L 的14 种磺胺类抗生素混合标准溶液，在上述条件下进样，所得14 种磺胺类抗生素质量浓度（X'）与色谱峰面积（Y'）的线性关系如表3所示，相关系数R2均在0.999 以上。分别以3 倍及10 倍信噪比确定14 种磺胺类抗生素的仪器检出限（LOD）与定量限（LOQ），14 种抗生素的LOD 与LOQ 分为0.1～0.5 μg/L 与0.2～1 μg/L。

2 结果与分析

2.1 提取液的选择

14 种磺胺抗生素在ACN 溶液、ACN 与HAc 体积比分别为95∶5、90∶10、85∶15、80∶20 的混合溶液和ACN、水与FA 体积比为800∶199∶1这6 种提取液条件下的提取回收率如表4 所示。结果显示，当以V(ACN)∶V(HAc)=80∶20 的ACN 与HAC 的混合溶剂作为提取溶剂时，各抗生素的提取回收率为53.78%～90.29%，此时14 种磺胺类抗生素平均提取回收率最高，为68.56%，因此选其作为提取溶剂。

2.2 响应面优化实验

通过Design-expert 8.0 软件设计的17 个实验方案及结果如表5 所示，14 种抗生素的平均提取回收率为43.51%～70.83%，其中，当缓冲液体积为5 mL、pH 为3、振荡时间为30 min 时，平均提取回收率最高，达到70.83%。

对实验方案设计及实验后得到的数据采用二次多项式方程进行拟合，并且根据方差分析结果对模型进行手动优化调整，使模型达到最优。最终，以平均提取回收率Y 作为因变量，缓冲液体积（X1）、缓冲液pH 值（X2）和振荡时间（X3）作为自变量，得到拟合方程如下：

模型拟合完毕后，用Design-expert 8.0 软件对该模型进行方差分析，检验模型的拟合程度，结果如表6所示，所拟合的二次多项式模型的P 值为0.000 3，P<0.05，表明所拟合的模型极显著。模型失拟P 值为0.491 8（P>0.05），失拟不显著，表明模型拟合较好。该模型的信噪比为14.277（大于4），表明模型可取。同时该模型的校正决定系数(Adj R2)和预测决定系数（Pred R2）分别为0.9168和0.852 1，且差值在0.2 之内，表明该模型与实测值拟合较好，可用于肥料中14 种抗生素平均提取回收率的预测和分析。

表214 种磺胺类抗生素的母离子、定量/定性离子及相应碰撞能量、锥孔电压Table2Parent ion, daughter ion, collision energy and cone voltage of14kinds of sulfonamide antibiotics

表314 种磺胺类抗生素的线性回归方程、检测限和定量限Table3Linear regression equations, detection limits and quantitative limits of14kinds of sulfonamide antibiotics

表4不同提取液条件下抗生素平均提取回收率Table4RER of antibiotics using different extraction solvents

表5响应面优化实验结果Table5Result of response surface experiment

回归模型的方差分析表显示，缓冲液体积（X1）和缓冲液pH（X2）对肥料中14 种抗生素的平均提取回收率的影响极显著（P<0.05），而缓冲液体积（X1）和缓冲液pH（X2）的交互影响以及缓冲液pH（X2）和振荡时间（X3）的交互影响对平均提取回收率的影响不显著（P>0.05）。

表6响应面模型方差分析表Table6Analysis of variance for response surface quadratic model

残差与方程预测值的对应关系图如图1(a)所示，本实验中得到的残差图显示预测值的残差均在±2.00 的范围内变化，且无规律地分散排布，但未超出±3.00，表明本实验所得到的回归方程对于预测值的拟合较理想。平均提取回收率的实验值与预测值的对应关系如图1(b)所示，图中各点代表了实测值，拟合直线代表了预测值，图中17 个点都分布在直线的附近，且偏离程度不大，表明本实验中所获得的回归模型能够比较准确地预测平均提取回收率，真实地反映出缓冲液体积、缓冲液pH 和振荡时间对平均提取回收率的影响情况。

图1残差与预测值（a）以及实验值与预测值（b）对比图Fig.1Internally studentized residuals versus predicted responses (a) and actual versus predicted responses (b)

为了更加直观地展示两两因素之间对平均提取回收率的交互作用，实验分析中利用Design-expert 8.0 软件绘制出了相应的响应面3D 图，如图2 所示。

图2(a)反映出当振荡时间不变时，平均提取回收率随缓冲液体积与缓冲液pH 变化的趋势，从图中可以直观地看到最高回收率在缓冲液pH 为3.0 和缓冲液体积为5 mL 附近取得。图2(b)反映出当缓冲液pH 不变时，平均提取回收率随缓冲液体积的减小而增大，随振荡时间的增加先减小后增大。图2(c)反映出当缓冲液体积不变时，平均提取回收率随缓冲液pH 的减小而增大。最终，通过模型拟合预计，当加入6.15 mL Na2EDTA-Mcllvaline 缓冲液（pH 3.0），振荡时间为20 min 时，14 种抗生素的提取回收率最高，可达73.46%。

图2不同因素相互作用对平均提取回收率的影响Fig.2Effects of binary interactions among different factors on the average recovery

2.3 回收率验证

按照添加标准物质的量与待测样品中存在的分析物质浓度范围相近的原则，设置肥料添加量为25、50 μg/kg 和100 μg/kg 这3 个低、中、高比例梯度[19-20]，在上述最佳前处理条件下，对肥料样品分别进行3 次重复实验，得到肥料中14 种抗生素的平均提取回收率，如表7 所示。

从表7 可以看到，验证实验中对添加量分别为25、50 μg/kg 和100 μg/kg 的肥料进行提取后得到的平均提取回收率分别为69.31%、73.89%、76.39%，与模型拟合预测的最佳平均提取回收率（73.46%）相比，分别相差4.15%、0.43%、2.93%，差值控制在5%之间，同时相对标准偏差RSD≤3.04%，说明所拟合的方程预测的平均提取回收率具有很强的实际应用性，即经过响应面实验优化确定的前处理条件可以作为最佳前处理条件。

表7最优前处理方法检验结果Table7Validation of optimal pretreatment method（n=3）

2.4 实际样品检测

应用经优化后的检测方法对6 个实际样品进行了测定，样品为猪粪、鸡粪和鸭粪肥3 种畜禽粪便以及3 种植物源有机肥，采自本地肥料销售点和生产厂家。结果重复性良好，在猪粪肥中检出608.08 μg/kg磺胺甲恶唑，鸭粪肥中检测到12.67 μg/kg 磺胺二甲异恶唑。

3 结 论

（1）建立了一种超高效液相色谱-串联质谱，同时测定有机肥中14 种磺胺类抗生素的方法，比较了不同提取剂的种类对提取效果的影响，通过响应面法对缓冲液体积、缓冲液pH 和振荡时间这3 个因素进行优化。模型拟合结果表明，当加入6.15 mL Na2EDTAMcllvaline 缓冲液（pH 3.0），振荡时间为20 min 的条件下提取14 种抗生素的提取回收率最高，为73.46%。

（2）对优化后的前处理方案进行验证，平均提取回收率为69.31%～76.39%，与预测值的差值在5%内，同时重现性较好（RSD≤3.04%），表明优化所得检测方法具有较强的实用性。应用本方法对6 个样品进行了测定，其中一个样品检出608.08 μg/kg 磺胺甲恶唑，另一个样品检出12.67 μg/kg 磺胺二甲异恶唑。