超短波干预对兔伸直型膝关节挛缩模型关节囊纤维化的影响

陈 爽，张全兵*，周 云，王 锋，刘阿英，黄鹏鹏，徐齐宇，徐元宏

临床上膝关节损伤十分常见，在损伤发生后常常需要对膝关节进行伸直位或功能位固定。如果固定时间或方式的不当，常常会导致膝关节伸直型挛缩，主要表现为膝关节的最大屈曲角度变小，使关节的屈曲活动受限。研究表明，关节挛缩形成的主要病理改变，体现在滑膜关节的萎缩、变性和粘连，在此之间，关节囊的纤维化在整个疾病进程中扮演了极为重要的角色。关节囊纤维化过程中涉及了多种细胞因子，并在调控细胞外基质的沉积和蛋白水平等方面发挥了关键作用，其致纤维化作用是近些年来研究的热点。

目前在临床上，关节挛缩发生后常采用超短波等物理因子治疗手段促进关节功能的恢复，但对其在治疗过程中的作用机制所知甚少。该研究通过建立兔伸直型膝关节挛缩模型，采用超短波疗法进行干预，旨在研究超短波疗法对于兔伸直型膝关节挛缩的治疗效果，并对关节挛缩发生后关节囊纤维化的发生机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

该实验方案经安徽医科大学机构动物护理与使用委员会批准，在实验过程中对新西兰白兔给予了人文关怀。本研究初期共使用32只雄性骨骼成熟新西兰白兔，3～4个月龄，体质量2～2.5 kg，购自安徽医科大学实验动物中心。将兔单独饲养在60 cm×50 cm×40 cm笼内，在24 ℃的环境温度下进行12 h的明-暗循环，允许笼内自由活动并获取水和食物。采用随机数字表法将这32只兔随机均分为4组：空白对照组(O组)、单纯固定组(P组)、自然恢复组(N组)、超短波治疗组(M组)。

1.2 干预方法

1.2.1

模型制备与固定 模型制备前需对所有兔均静脉注射戊巴比妥钠麻醉(30 mg/kg)。在O组中，兔左膝关节未进行固定并饲养12周。在P组中，兔左膝关节进行8周管形石膏固定以形成左侧膝关节挛缩，如文献报道使用的方法，采用电动剃毛刀自左腹股沟到足趾近端剃除体毛，尔后左膝关节完全伸直、左踝关节跖屈60°，绵纸2～3层包裹后按照石膏固定操作方法自左腹股沟至足趾部，注意留出足趾远端以观察末梢血运(图1)。在N组中，兔左膝关节进行8周管形石膏固定以形成左侧膝关节挛缩，随后拆除石膏进行为期4周的自然恢复。在M组中，兔左膝关节进行8周管形石膏固定，随后拆除石膏进行为期4周的超短波治疗。

图1 膝关节挛缩模型的制备

1.2.2

超短波治疗 设备预热后，将每只需要接受超短波治疗的新西兰白兔放置在绝缘的木桌上，选择电极对置法，将左下肢暴露于超短波治疗设备的电极中。剂量调整为微热量，并将治疗时间设置为15 min，每日1次。

1.3 实验补充

本次实验过程中共出现2只新西兰兔计划外死亡，分别发生在实验第3日的P组和第15天的N组。将尸体交由校实验动物中心处理，两组各补充1只新西兰兔，按各组实验方法进行同样规格的麻醉与模型制备，并按照各组要求进行相应时长的固定和干预。因此本次实验中实际使用新西兰兔34只。

1.4 肌切开术后关节活动度的测量

在每个时间点末，所有新西兰兔被过量的戊巴比妥钠安乐死。兔后肢在左髋关节处被脱位，并切断髋关节处大腿肌群的起始点，完全剥离左下肢。参考文献报道的方法，利用关节活动度测量仪测量肌切开术后的左膝关节活动度(图2)。

1.5 膝关节后方关节囊Masson染色

关节活动度测量后，取膝关节后方关节囊，平均分为两份。一份用4%多聚甲醛固定，留做Masson染色，另一份立即经液氮转移置入-70 ℃冰箱中保存，用于半定量RT-PCR和Western blot检测。固定的关节囊脱水、透明、石蜡包埋。制作5 μm切片、粘片、烤片过夜，保存至4 ℃环境中。分别采用Masson复合染色液(试剂A)、磷钼酸、苯胺蓝染色，分化后脱水、透明、封固。采集图像完成后，Image Proplus 2.0测定阳性区域(蓝色)面积所占的百分比，计算平均值，以此作为胶原沉积的衡量指标。

图2 测量膝关节在切除所有肌肉后的活动度

1.6 半定量RT-PCR法检测关节囊转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)与结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)的mRNA表达

利用TRIzol试剂提取总RNA，按RT-PCR试剂盒说明书进行cDNA的合成，以此cDNA为模板进行PCR反应。产物经质量分数2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统摄像，进行吸光度(A)值扫描，并进行相对量分析，用目的因子与β-actin条带吸光度相比表示相对灰度值。TGF-β1上游引物为5′-AGGAAGGAGGGCTGGAACA-3′,下游引物为5′-CCATCTACGAGGGCTACGC-3′;CTGF上游引物为5′-ACAAGGGACTCTTCTGTGACTTCGG-3′,下游引物为5′-CCAGGCAGTTGGCTCGCATC-3′。

1.7 Western blot法检测TGF-β1、CTGF的蛋白表达

制备组织匀浆，离心取上清液，所有操作均在低温条件下进行。考马斯亮蓝蛋白定量后，上清液分装于离心管中并静置于-70 ℃环境中。安装电泳槽，待测蛋白与低分子量标准蛋白各加样10 μl，采用5%浓缩胶和12%的分离胶进行SDS-PAGE。结束后刮掉浓缩胶，进行染色，90伏特低温下电转移3 h，4 ℃封闭过夜；加入特异性识别抗体一抗，TGF-β1稀释比例为1∶500，CTGF稀释比例为1∶200，37 ℃缓慢摇动1 h，再次封闭过夜，弃除抗体液，缓冲液摇动漂洗NC膜3次×10 min/次。加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔抗体二抗，TGF-β1 1∶100稀释，CTGF 1∶5 000稀释，37 ℃缓慢摇动2 h，作用结束后弃除，以1×TBS缓冲液摇动漂洗NC膜3次×5 min/次。

2 结果

2.1 肌切开术后膝关节活动度

O、P、N、M组的肌切开术后膝关节活动度分别为(140.73±4.02)°、(85.12±1.56)°、(85.52±2.45)°、(89.56±2.57)°。各组间比较

F

=776.01，总体组间差异有统计学意义(

P

<0.05)，两两比较除P与N组外各组间的差异有统计学意义(

P

<0.05)。P、N、M组肌切开术后膝关节活动度均小于O组(

P

<0.05)；P组与N组肌切开术后膝关节活动度均小于M组(

P

<0.05)，P组与N组肌切开术后膝关节活动度无明显差异。

2.2 膝关节后方关节囊胶原蛋白百分比

如图3所示，O、P、N、M组的胶原百分比分别为(19.50±1.70)%、(44.13±2.48)%、(41.14±2.03)%、(37.39±1.94)%。各组间比较

F

=347.26，差异有统计学意义(

P

<0.05)。P、N、M组胶原百分比均大于O组(

P

<0.05)；P组胶原百分比大于N组和M组(

P

<0.05)；N组胶原百分比大于M组(

P

<0.05)。

图3 各组膝关节后方关节囊Masson染色 ×400

2.3 TGF-β1的mRNA表达

4组兔膝关节后方关节囊TGF-β1 mRNA相对表达情况见图4，各组间比较

F

=957.00，差异有统计学意义(

P

<0.05)。O组膝关节后方关节囊TGF-β1的mRNA水平小于P、N、M组(

P

<0.05)；P组膝关节后方关节囊TGF-β1的mRNA水平大于N组、M组(

P

<0.05)；N组膝关节后方关节囊TGF-β1的mRNA水平大于M组(

P

<0.05)。

图4 兔膝关节后方关节囊TGF-β1 mRNA的相对表达量

2.4 TGF-β1的蛋白表达

4组兔膝关节后方关节囊TGF-β1蛋白相对表达量情况见图5，各组间比较

F

=699.36，差异有统计学意义(

P

<0.05)。O组膝关节后方关节囊TGF-β1的蛋白表达水平小于P、N、M组(

P

<0.05)；P组膝关节后方关节囊TGF-β1的蛋白表达水平大于N、M组(

P

<0.05)；N组膝关节后方关节囊TGF-β1的蛋白表达水平大于M组(

P

<0.05)。

图5 兔膝关节后方关节囊后方关节囊TGF-β1的蛋白质表达水平

2.5 CTGF的mRNA表达水平

4组兔膝关节后方关节囊CTGF mRNA相对表达情况见图6，各组间比较

F

=931.22，差异有统计学意义(

P

<0.05)。O组膝关节后方关节囊CTGF的mRNA表达水平小于P、N、M组(

P

<0.05)；N组膝关节后方关节囊CTGF的的mRNA表达水平大于P、M组(

P

<0.05)；P组膝关节后方关节囊CTGF的的mRNA表达水平低于N组和M组(

P

<0.05)。

图6 兔膝关节后方关节囊CTGF mRNA的相对表达量

2.6 CTGF的蛋白表达

4组兔膝关节后方关节囊CTGF的蛋白相对表达量情况见图7,各组间比较

F

=544.75，总体间差异有统计学意义(

P

<0.05)；除P组与N组外(

P

>0.05)，其余各组两两之间差异有统计学意义(

P

<0.05)；O组膝关节后方关节囊CTGF的蛋白表达水平小于P、N、M组(

P

<0.05)。

图7 兔膝关节后方关节囊后方关节囊CTGF的蛋白相对表达量

3 讨论

临床上，关节损伤发生后接受长时间的不适当外固定，且在此期间及之后未进行系统科学的康复治疗，易发生关节挛缩。其病理上表现出关节囊和关节周围韧带的纤维化以及骨骼肌的废用性萎缩，进而出现关节主动或被动活动度减低，给患者的日常生活活动和心理健康带来了十分不利的影响。在关节囊纤维化的形成过程中，有关研究表明关节囊产生了多种促纤维化颗粒，包括有TGF-β1、CTGF以及其他多种细胞因子和酶类等，且TGF-β1、CTGF存在着相互作用的关系。

本研究将空白对照组与单纯固定组进行对比，随着固定8周后关节挛缩的形成，单纯固定组在出现肌切开术后膝关节活动度下降、膝关节后方关节囊Masson染色胶原百分比明显地增加，在证明利用长时间固定制备兔膝关节关节挛缩的可行性的同时，TGF-β1与CTGF的mRNA、蛋白表达水平也出现相应升高，证实了TGF-β1、CTGF与膝关节挛缩发生的相关性，关节挛缩的形成伴随着TGF-β1与CTGF的高表达。

在单纯固定组与自然恢复组间对比中，TGF-β1、CTGF的mRNA水平与TGF-β1的蛋白表达水平均表现为单纯固定组显著高于自然恢复组，肌切开术后膝关节活动度无明显差异，而CTGF的蛋白水平却表现为自然恢复组大于单纯固定组。Mori et al向鼠的皮下单独注入TGF-β1，仅仅产生了短暂可逆的肉芽组织，连续注射7 d后肉芽组织消失并且无纤维化组织形成。单独的外源性CTGF注射同样不能产生持久的纤维化。然而，同时注射这两种细胞因子则导致了持续两周以上的纤维化组织形成。Takehara的小鼠持续纤维化模型则提示在病变初期未观察到CTGF mRNA的表达，而在纤维化的末期，可观察到其水平有明显上升，TGF-β1的观察结果显示其表达会随着固定时间的延长而逐渐下降。表明组织纤维化前期主要由TGF-β1诱导，而中期CTGF发挥辅助作用并维持组织纤维化。本实验中的结果恰好与该观念相互验证，提示：① 关节挛缩一旦形成后，关节囊纤维化恢复进展较慢，至少在本研究中4周的自然恢复期不足以使其肌切开术后膝关节活动度表现出差异；② TGF-β1作用时间为关节挛缩进展的前期，随着时间的推移水平会逐渐下降；③ CTGF的基因表达和蛋白表达量表达不成绝对相关性；④ CTGF的翻译表达蛋白复杂且历时较长；⑤ CTGF在维持挛缩形成的进程中作用持久。较为遗憾的是本实验未能设置固定不同时间梯度的分组更加详细地探究挛缩形成的确切进展与TGF-β1和CTGF表达升高的时间相关性，这将是接下来研究完善的一大方向。

将本研究中的自然恢复组与超短波治疗组进行比较，超短波治疗组的肌切开术后膝关节活动度恢复更大，而膝关节后方关节囊胶原百分比、TGF-β1与CTGF的蛋白、mRNA表达水平的各项指标均降低，在各项指标上都证明超短波疗法对于关节挛缩的进展有着抑制作用。超短波属于高频电治疗范围，被证明有降低炎症反应，改善关节僵硬，缓解疼痛等多种治疗作用。高频电治疗的原理是电场中产生的热能，相较于传统热疗而言，热能作用可抵达更深处的组织，且分布均匀。高频电产热超短波可调节血管内皮细胞的合成和释放，继而引起小动脉及毛细血管扩张，血流速度加快，血管再生增加。本研究中，超短波治疗组与自然恢复组相比，肌切开术后膝关节活动度有明显好转，TGF-β1与CTGF的mRNA表达、TGF-β1与CTGF的蛋白表达得以抑制，证明应用超短波疗法进行干预可以在一定程度上逆转关节囊纤维化并改善关节挛缩程度，并且可能是通过调控CTGF及TGF-β1的表达实现的。

此前，大多数的膝关节挛缩动物实验模型均采用了屈曲型膝关节挛缩的模型，而在临床上伸直型膝关节挛缩更为常见，主要表现为膝关节屈曲活动的限制。为此本研究采用了已经成功制备的兔伸直型膝关节挛缩模型，通过超短波疗法的介入，使关键的促纤维化因子表达水平降低，在一定程度上改善伸直型膝关节挛缩程度，可能为超短波在关节挛缩中的应用提供新的理论基础。

但是超短波疗法抑制了CTGF、TGF-β1的表达，还是促进了CTGF、TGF-β1的分解，亦或两者皆有，甚至于考虑到二者的相互协同作用，超短波仅通过影响其中之一而改变了两者的表达量，本实验结果不足以解释其具体扮演了怎样的角色，需要进一步研究。且该研究主要局限于动物模型中，伸直型膝关节挛缩的治疗方法仍需进一步探讨。

(致谢：感谢安徽医科大学公共卫生学院王华教授对于本文的指导！本研究受到陆军军医大学第一附属医院唐康来教授牵头的国家重点领域创新团队-运动损伤修复与重建创新团队项目资助，在此表示诚挚的感谢！)