汉黄芩素经PTEN/PI3K/AKT信号通路对乳腺癌细胞增殖的影响

陈 旭，郑 玉，彭 泉，陈 亮，张明金，赵成功，任桂灵

乳腺癌在成年女性中有很高的发病率，全球每年新增乳腺癌患者约138万，我国乳腺癌病死率达到了60%。化学药物治疗取得了很好的效果，但是化疗存在很多毒副作用，给患者带来了巨大的痛苦。汉黄芩素为黄酮类化合物，同时还是中药黄芩的主要活性成分，很多研究表明该化合物不仅可以抗炎、抗过敏、抗病毒、抗惊厥及血管保护等多种药理学活性，该化合物还表现出一定的抗肿瘤效果，比如诱导皮肤癌细胞的凋亡,抑制肺癌细胞黏附和迁移能力。该实验以mcf-7细胞为对象研究汉黄芩素通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对乳腺癌细胞体内外增殖的影响，为汉黄芩素治疗乳腺癌及其抗肿瘤活性提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

细胞株 人乳腺癌细胞株mcf-7由中国科学院上海生命科学院细胞库提供。

1.1.2

实验材料 汉黄芩素购于美国Sigma-Aldrich公司；DMSO购于上海生工；PRMI-1640培养基、胎牛血清以及双抗购于美国Gibco公司；CCK-8增殖检测试剂盒、蛋白定量检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒及ROS检测试剂盒购于上海贝博生物有限公司；小鼠抗β-actin抗体(ab8226)、兔抗PCNA抗体(ab92552)、兔抗Caspase-3抗体(ab13847)、兔抗Cleaved-Caspase-3抗体(ab2302)、兔抗PTEN抗体(ab32199)、兔抗Ki67抗体(ab16667)、兔抗p-PI3K抗体(ab32089)以及兔抗p-AKT抗体(ab8805)购于英国 Abcam公司，所有抗体稀释比例均为1∶1 000。

1.1.3

实验动物 12只SPF级BALB/c雌性裸鼠，3～5周龄，体质量(15～20) g，购自南京大学模式动物研究所动物中心，于安徽医科大学实验动物中心SPF级环境下饲养。

1.1.4

仪器 CO恒温培养箱 (美国Thermo公司)；全波长多功能酶标仪(瑞士 Tecan公司)；流式细胞仪(美国Beckman公司)；FUSION-FX5-820多功能成像系统 (法国VILBER公司)。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养及药物处理 常规方法复苏冻存于液氮罐中的乳腺癌细胞株mcf-7，将其接种于含10% FCS的RPMI-1640培养液的培养瓶中，置于培养箱中常规培养 (37 ℃、5% CO、饱和湿度)，24 h后首次换液，去掉未贴壁细胞，每隔3 d换液，待细胞生长融合达80%～90%时，取对数生长期的细胞进行实验。将试验细胞分为4组，每组按照1×10个/ml的密度接种，并用不同浓度汉黄芩素 (0、20、50、100 μmol/L) 分别处理各组细胞并用于后续实验。

1.2.2

流式细胞术检测细胞周期 将对数生长期的mcf-7细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，用不同浓度的汉黄芩素 (0、20、50、100 μmol/L) 作用于乳腺癌细胞48 h，用胰蛋白酶处理细胞，收集细胞，遇冷后，用70%多聚甲醛固定细胞后，用PBS清洗细胞，然后用细胞周期检测试剂盒处理，最后用流式细胞仪检测，重复3次，最后用Modifit软件处理细胞，分析细胞周期分布。

1.2.3

细胞凋亡检测 将对数生长期的mcf-7细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，用不同浓度的汉黄芩素(0、20、50、100 μmol/L)作用于乳腺癌细胞48 h，用胰蛋白酶处理细胞，收集细胞，然后根据凋亡试剂盒说明书，对细胞进行Annexin V-FITC/PI双染，最后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4

Western blot检测蛋白表达 收集处理好的mcf-7细胞，加入适当的细胞裂解液，在恒温摇床上孵育裂解30 min，12 000 r/min 4 ℃离心20 min，然后提取上清液，用蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白样品与加样缓冲液等体积混合后沸水中煮沸10 min，经10% SDS-PAGE 凝胶电泳后半干转至 PVDF膜，孵育一抗过夜，孵育过夜后室温孵育二抗，用ECL化学发光显色，曝光。用ImageJ软件分析蛋白条带，最后计算目的条带和β-actin 的比值。

1.2.5

CCK-8法 将对数生长期的mcf-7乳腺癌细胞采用胰蛋白酶进行消化，接种于96孔培养板(1×10/ml)，置于37 ℃、5% CO的培养箱内24 h后，对照组加入0.1% DMSO，用汉黄芩素(0、20、50、100 μmol/L) 处理mcf-7乳腺癌细胞，分别培养24、48、72 h。然后每孔加入10 μl 10% CCK-8工作液，完毕后于孵化箱中孵育4 h，于波长为450 nm处的酶标仪测定吸光度(optical density,OD)值。计算细胞存活率/%=[(OD-OD)/(OD-OD)]×100%。

1.2.6

裸鼠移植瘤模型 裸鼠适应环境1周后，碘伏消毒裸鼠右侧腋下皮肤，注射200 μl制备好的mcf-7细胞悬液，含有1×10个细胞，接种完后每天观察肿瘤生长情况，裸鼠的活动状况。待肿瘤体积达到50 mm后，将裸鼠随机分为2组：对照组、汉黄芩素组 (10 mg/kg)，每组6只，并采用灌胃方式进行给药， 剂量为100 kg/L，每2 d给药1次，每次给药前测定裸鼠移植瘤体积和裸鼠体质量，连续给药21 d，颈椎脱臼处死。

1.2.7

转录组测序方法 将对数生长期的mcf-7细胞接种于培养瓶中，待细胞贴壁后，用分别用0 μmol/L和100 μmol/L浓度的汉黄芩素处理乳腺癌细胞48 h后，用胰蛋白酶处理细胞，收集细胞，用PBS清洗细胞，紧接着进行转录组测序，提取样品总RNA并使用DNase消化DNA后，用带有Oligo (dT) 的磁珠富集真核生物mRNA (若为原核生物，则通过试剂盒去除rRNA来富集mRNA)；加入打断试剂将mRNA打断成短片段，以打断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链成反应体系合成二链cDNA，并使用试剂盒纯化双链cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer质检合格后，使用Illumina HiSeq2500测序仪进行测序，产生125 bp或150 bp的的双端数据。质检合格后，使用Illumina测序仪进行测序。

2 结果

2.1 汉黄芩素对mcf-7细胞增殖的影响

汉黄芩素对乳腺癌mcf-7细胞增殖活性的抑制效果见图1。结果显示不同浓度(0、20、50、100 μmol /L) 的汉黄芩素作用mcf-7细胞24、48、72 h后均能抑制乳腺癌细胞株mcf-7的增殖水平(

F

=22.31，

P

<0.05)，并呈现出浓度和时间依赖性，即随着汉黄芩素浓度和时间的增加，抑制效果增强。

图1 汉黄芩素对乳腺癌细胞mcf-7细胞增殖活性的影响

2.2 汉黄芩素对mcf-7细胞周期的影响

如图2所示，与对照组相比，汉黄芩素处理组中细胞处于G0/G1期的百分比增加(

F

=40.11，

P

<0.01)，且呈浓度依赖性，即汉黄芩素使mcf-7细胞周期阻滞于G0/G1期。

图2 汉黄芩素对乳腺癌细胞mcf-7细胞周期的影响

2.3 汉黄芩素对mcf-7细胞中PCNA蛋白水平的影响

Western blot结果(图3)所示，与对照组相比，汉黄芩素 (20、50、100 μmol/L) 处理mcf-7细胞48 h后，增殖标志性蛋白PCNA表达水平降低(

F

=37.64，

P

<0.05)。

2.4 汉黄芩素对mcf-7细胞凋亡的影响

与对照组相比，不同浓度的汉黄芩素(20、50、100 μmol/L) 处理mcf-7细胞48 h后，Annexin-V FITC /PI双染结果如图4所示，与对照组相比，随着汉黄芩素给药浓度的增加，细胞凋亡的百分率升高，差异有统计学意义 (

F

=49.45，

P

<0.01)。表明汉黄芩素能够诱导mcf-7细胞凋亡，并呈剂量依赖性。

图3 汉黄芩素对乳腺癌细胞mcf-7细胞中PCNA蛋白表达水平的影响

图4 汉黄芩素对乳腺癌细胞 mcf-7 细胞凋亡的影响

2.5 汉黄芩素对mcf-7细胞中Caspase-3和Cleaved-Caspase-3蛋白水平的影响

与对照组相比，不同浓度的汉黄芩素(20、50、100 μmol/L)处理mcf-7细胞48 h后，Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平逐渐升高，Caspase-3蛋白表达水平逐渐降低(

F

=56.32，

P

<0.01)。见图5。

图5 汉黄芩素对乳腺癌细胞 mcf-7 细胞中Caspase 3和Cleaved-Caspase 3蛋白表达水平的影响

2.6 汉黄芩素对mcf-7细胞中PTEN/PI3K/AKT信号轴的影响

通过对汉黄芩素处理的mcf-7细胞进行转录组测序分析，分析热图如图6A所示。KEGG通路分析结果显示汉黄芩素在乳腺癌治疗过程中主要和PI3K/AKT信号通路及其关键上游蛋白PTEN有关(图6B)。Western blot实验结果表明，与对照组相比，不同浓度汉黄芩素处理mcf-7细胞48 h后，抑癌蛋白PTEN表达水平随着浓度升高逐渐增加，p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平随着浓度升高降低 (

F

=37.42，

P

<0.05；

F

=48.54，

P

<0.01)(图6C)。

2.7 汉黄芩素对体内裸鼠移植瘤的影响

如图7A所示，汉黄芩素可以抑制mcf-7异种移植模型中的肿瘤生长，给药21 d后，对照组的肿瘤质量已达到约2 g以上，但在10 mg/kg汉黄芩素给药组中，平均肿瘤质量只有0.7 g左右 (图7B)。由此从体内验证了汉黄芩素可以抑制移植瘤的增长。Western blot实验结果如图7C表明，与对照组相比，汉黄芩素可以抑制增殖标志性蛋白PCNA和Ki67的表达(

F

=30.78，

P

<0.05)。

图6 汉黄芩素对乳腺癌细胞 mcf-7 细胞 PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响

图7 汉黄芩素对体内裸鼠移植瘤的影响

3 讨论

乳腺癌作为致死率非常高的恶性肿瘤，约占女性肿瘤的1/4，发病特点是侵袭性强，复发率高，且该疾病的进展缓慢，已经成为国内外研究的热点。临床上乳腺癌治疗主要采用手术切除后化疗，但是化疗的耐药性和毒副作用是限制其使用的两大方面。本研究结果显示汉黄芩素可以抑制mcf-7细胞增殖，并且诱导其凋亡。汉黄芩素有很大的潜力被开发成新型的抗肿瘤一线药物。

肿瘤的发生主要是不受控制的恶性增殖以及凋亡受阻。很多药物主要是采用抑制增殖诱导凋亡发挥作用。该研究中流式细胞术和Western blot结果显示汉黄芩素可以阻滞细胞周期、抑制增殖，促进细胞凋亡并且调节凋亡相关蛋白的表达，例如 Caspase3和Cleaved-Caspase3蛋白。

为了进一步探讨汉黄芩素调节乳腺癌的潜在机制，运用转录组测序，预测其可能涉及的信号通路，结果显示，汉黄芩素可能是通过调节 PTEN/PI3K/AKT 信号通路抑制乳腺癌增殖并且诱导凋亡。作为经典的抑癌蛋白，PTEN 在细胞增殖细胞凋亡等过程中发挥重要的作用，PTEN 的表达异常可能会干扰细胞凋亡和增殖。本研究结果显示汉黄芩素可升高乳腺癌细胞中 PTEN 的表达。这提示汉黄芩素对于增殖和凋亡的调节可能是通过PTEN发挥作用的。此外，PTEN是PI3K/AKT信号通路的关键调节蛋白，PTEN 和PI3K/AKT呈负相关，PTEN的表达降低可以激活该信号通路。当 PTEN/PI3K/AKT 信号通路被抑制时，往往可以抑制肿瘤增殖诱导凋亡。本实验结果显示，与对照组相比，汉黄芩素可以抑制 p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的表达，同时促进 PTEN 的表达水平。因此，汉黄芩素通过调节PTEN/PI3K/AKT信号通路来抑制mcf-7增殖和诱导来发挥作用。