抑癌基因PDCD4的表达对南蛇藤提取物抑制人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响

巴 赫，彭 强，朱耀东

近年来胃癌已俨然成为威胁人类健康的重要疾病之一。中医药是我国肿瘤防治工作中的重要组成部分，具有独特的优势与特色。因此筛选和开发具有抗胃癌作用的中药具有重要的医药价值和社会意义。南蛇藤性味辛温，有微毒，归属肝经、膀胱经，具有祛风、活血、消肿、止痛、解毒等功效。前期研究发现南蛇藤提取物(

Celastrus

Orbiculatus

extract, COE)可有效抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生长，其机制可能与抑制肿瘤上皮间质转化(epithelial mesenchymal transitions, EMT)的发生有关。程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)是一种抑癌基因，可以通过抑制蛋白质的翻译起到抑制肿瘤作用。课题组长期致力于PDCD4与胃癌发生发展的相关机制方面的研究。前期研究表明PDCD4可能参与COE对大鼠胃癌前病变发生的抑制作用，然而其在COE抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤生长中的作用尚不完全清楚。该研究拟通过建立高表达PDCD4的稳定转染胃癌细胞株，进一步探讨抑癌基因PDCD4的表达变化在COE抑制人胃癌裸鼠荷瘤模型生长中的作用，为开发新型的抗肿瘤药物提供新的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

药物 南蛇藤中药饮片，批号070510，购于广州致信药业有限公司。COE的制备方法已获得国家发明专利。主要流程如下：将南蛇藤茎饮片切断，粉碎成粉，95%乙醇加热回流提取3次，回收溶剂至干，加水分散后，用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3次，回收溶剂后减压浓缩并进行真空冻干，得到COE。

1.1.2

细胞株及动物 人胃癌细胞株SGC-7901购于中国科学院上海细胞库。35只BALB/C无胸腺裸鼠，SPF级，6周龄，雄性，体质量18～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK (京) 2016～0006，在安徽医科大学实验动物中心屏障系统辅以洁净层流柜环境中饲养。

1.1.3

仪器 Heracell150i型CO培养箱(美国Thermo公司)；ChemiDoc XRS+型全自动化学发光凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；Power/Pac300型稳压稳流电泳仪、Trans-blot SD型转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

1.1.4

试剂 RPMI-1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司，批号分别为1517544、10270)；0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone公司，批号为J140028)；质粒由课题组前期构建，在实验室留存；兔抗人GAPDH一抗(美国Stanta Cruz公司,批号SC32233)；兔抗人PDCD4一抗、兔抗人E-cadherin一抗、兔抗人N-cadherin一抗、兔抗人Vimentin一抗(英国Abcam公司，批号分别为：ab76055、AF4039、AP2739B、GR106729-14)；山羊抗兔HRP标记免疫球蛋白(Ig)G二抗(美国EarthOx公司，批号E03012001)；cDNA逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒(日本Takara公司，批号RR047A、RR430A)ECL检测试剂盒(沈阳万类生物科技有限公司，批号WLA003)；PVDF膜(美国Millipore公司，批号IPVH00010)；基质胶(美国Corning公司，批号356234)；DBA试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司，批号DAB2031)。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养 人胃癌SGC-7901细胞株置于37 ℃、 5%CO的细胞培养箱中用含有10%胎牛血清的培养基进行培养，每2～3 d采用胰蛋白酶对细胞进行传代处理，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2

稳定转染胃癌细胞株建立 参照说明书，用lipofectamine 2000将真核表达质粒pcDNA3.1-PDCD4转染至人胃癌细胞系SGC-7901。转染后采用G418筛选阳性克隆，并且继续培养。用Western blot及RT-PCR法检测PDCD4基因蛋白及mRNA的表达。

1.2.3

Western blot检测 收集转染48 h后的SGC-7901胃癌细胞，加入RIPA裂解液进行裂解，提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白浓度进行测定，SDS-PAGE电泳分离，转到PVDF膜，脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，加入PDCD4一抗(1∶10 000)，4 ℃孵育过夜，PBST缓冲液漂洗3次，加入二抗(1∶5 000)，37 ℃反应1 h，用ECL试剂盒显影，以GAPDH作为对照，用Image J软件对条带灰度值进行分析。

1.2.4

RT-PCR法检测 通过TRIzol法提取总RNA，通过分光光度计法检测RNA的完整性，符合逆转录实验要求后根据cDNA合成试剂盒说明书逆转录合成cDNA，逆转录条件：37 ℃、30 min，98 ℃、5 min，-20 ℃保存。而后以cDNA为模板，与基因特异性引物进行PCR扩增PDCD4,而后进行相对定量分析。

1.2.5

裸鼠皮下移植瘤模型的建立 取对数生长期胃癌细胞，用生理盐水调整细胞密度至1×10/ml，随机分为正常组、对照组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-PDCD4组、COE组[40 mg/(kg·d)]、pcDNA3.1+COE组、pcDNA3.1-PDCD4+COE组，每组5只，于每只裸鼠右侧胁部皮下注射0.2 ml。接种时局部出现皮丘，待皮下可触及肿块，隆起于皮肤表面，呈不规则状，边界清楚，直径大约3～4 mm，提示裸鼠人胃癌皮下移植瘤模型建立成功。COE组给予灌胃给药，连用3周，每次0.2 ml，其余各组灌注等量的生理盐水。给药过程中每天定时观察裸鼠精神状态、活动、饮食等一般情况。

1.2.6

肿瘤体积及质量测定 从给药当天开始，每隔2 d称量并记录裸鼠体质量，并用游标卡尺测量移植瘤的长径(a)及与之垂直的短径(b)，计算肿瘤体积(V=a×b/2)，绘制移动瘤的生长曲线。治疗结束后次日，颈椎脱臼处死裸鼠，完整剥离肿瘤组织，称取瘤重，并计算其抑瘤率，抑瘤率=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

1.2.7

免疫组化法检测 取肿瘤组织，切片脱蜡水化，利用HO溶液处理以消除内源性过氧化物酶，微波修复抗原，10%山羊血清封闭30 min，加入一抗(PDCD4, 1∶400；E-cadherin,1∶200；N-cadherin，1∶500；Vimentin，1∶500)，4 ℃孵育过夜，用PBS缓冲液冲洗3次，加入二抗，37 ℃孵育1 h，DAB显色，苏木精复染，中性树脂封片。在400倍镜下随机选取5个视野，通过Image-Pro Plus 6.0软件对切片的着色强度进行分析，测定积分吸光度值。

2 结果

2.1 质粒转染后PDCD4蛋白和mRNA表达

Western blot检测结果显示，与对照组相比，pcDNA3.1-PDCD4组PDCD4蛋白表达量增加(

P

<0.05)，pcDNA3.1组PDCD4蛋白表达量无变化。见图1。RT-PCR检测结果显示，与对照组相比，pcDNA3.1-PDCD4组PDCD4 mRNA表达量增加(

P

<0.05)，pcDNA3.1组PDCD4 mRNA表达量无变化，提示稳定转染PDCD4 cDNA的SGC-7901细胞株构建成功。见图2。

2.2 COE对胃癌裸鼠皮下移植瘤模型生长的影响

pcDNA3.1-PDCD4组、COE组、pcDNA3.1+COE组、pcDNA3.1-PDCD4+COE组移植瘤生长受到抑制，肿瘤体积以及质量均降低(

P

<0.05)，4组的抑瘤率分别为59.29%、57.52%、58.41%、71.68%。其中pcDNA3.1-PDCD4+COE组抑瘤率高于其余组(

P

<0.01)。见图3、表1。

图1 Western blot法监测质粒转染后SGC-7901细胞中PDCD4蛋白表达

图2 RT-PCR法检测质粒转染后SGC-7901细胞中PDCD4 mRNA表达表达水平

图3 COE对裸鼠皮下移植瘤模型中移植瘤体积的影响

表1 COE对裸鼠皮下移植瘤模型中移植瘤重量的影响

2.3 COE对肿瘤组织中蛋白表达的影响

pcDNA3.1-PDCD4组、COE组、pcDNA3.1+COE组、pcDNA3.1-PDCD4+COE组中PDCD4、E-cadherin的蛋白表达水平较对照组上调(

P

<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平下调(

P

<0.05);其中pcDNA3.1-PDCD4+COE组中上述4种蛋白表达水平变化幅度更大(

P

<0.01)。见图4、表2。

3 讨论

近年来，以传统中医药理论为指导，与现代最前沿的医学理论和研究成果相结合，从具有抗肿瘤作用的单味中药或复方中，筛选具有防治胃癌的药物，深入研究其作用机制，有着非常重要的意义。既体现了中医药简、便、验、廉的特色优势，又为胃癌预防药物的研究提供了广阔的药物资源。EMT指在某些刺激因素作用下上皮细胞转化为间质细胞的过程，主要表现为上皮细胞失去极性，从原有的紧密连接状态转变为松散孤立的状态并获得较强的运动和迁移能力。EMT在胚胎发育、损伤修复等生命活动中具有重要作用，并与器官纤维化及肿瘤等多种疾病的发生发展关系密切。其主要的分子特征包括：上皮标志因子如E-cadherin等表达减弱，N-cadherin、vimentin等间质细胞标志物表达上调。近年来研究表明EMT作用增强可以赋予肿瘤细胞转移和侵袭能力并促进肿瘤细胞增殖。在前期研究中显示COE可以通过减弱EMT作用对胃癌细胞的增殖和转移起到抑制作用，本研究中观察到用COE对胃癌移植瘤裸鼠模型进行治疗后可以减缓移植瘤生长并上调E-cadherin表达，抑制N-cadherin、Vimentin表达，与前期研究结果一致，证实COE可以通过抑制EMT过程起到抗胃癌作用。此外，该研究还表明COE可以上调PDCD4蛋白表达水平。

表2 COE对肿瘤组织中PDCD4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平的影响

图4 COE对肿瘤组织中PDCD4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响 免疫组化 ×400

PDCD4是一种高度保守的蛋白，可以通过其MA-3结构域与真核翻译起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor 4 A，eIF4A)结合，调节细胞的转录和翻译水平。已有多项研究发现PDCD4可以通过抑制EMT过程对肿瘤的发生发展起到抑制作用。Hu et al发现PDCD4可以通过下调EMT通路激活因子EIF3H表达减弱EMT作用，抑制胃腺癌细胞的增殖和转移；Ji et al发现敲除PDCD4后肝癌细胞的EMT作用增强，并获得更强的转移和侵袭能力。本研究中，通过转染pcDNA3.1-PDCD4质粒提高SGC-7901胃癌细胞PDCD4表达水平后发现E-cadherin表达增强，N-cadherin、Vimentin表达减弱，移植瘤生长受到抑制；提高PDCD4表达水平可以增强COE对EMT的抑制作用及其抗胃癌活性，表明COE通过上调PDCD4表达抑制EMT过程而对胃癌移植瘤的生长起到抑制作用。

综上，PDCD4可以通过减弱胃癌细胞的EMT作用参与COE抗胃癌过程。

miR

-21是一种内源性非编码小分子单链RNA，位于PDCD4的上游，且已被证实与EMT的发生相关。接下来将对

miR

-21在COE抑制胃癌过程中扮演的角色进行探究，以更好地了解COE防治胃癌的具体机制以及作用靶点，为COE对胃癌的防治提供参考和指导。