IGFBP2增强IGF-1诱导的HepG2细胞增殖、迁移和侵袭

张 雨，崔东倩，刘 倩，韩陈陈，罗婷婷，马 旸，魏 伟

胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是IGF家族成员，可与胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)结合并参与肿瘤的发生发展。研究表明IGF-1可以促进黑色素瘤细胞转移；还可通过上调早期生长反应蛋白1(early growth response 1, EGR1)的表达增强肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)细胞的迁移和侵袭能力。胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin-like growth factor binding protein 2，IGFBP2)是循环系统中含量第二大的IGFBPs。IGFBP2结构中含有IGF结合区域，可在循环中与IGF形成复合物并调节IGF功能。IGFBP2可通过调控IGF/IGFR信号通路促进肿瘤进展，但IGFBP2在IGF-1诱导肝癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用尚未有报道。

该研究选用不同浓度IGFBP2与IGF-1联合刺激HepG2细胞，用CCK-8法检测细胞增殖，transwell法检测细胞迁移和侵袭，Western blot检测胞内信号通路相关蛋白的活化和表达，旨在揭示IGFBP2在IGF-1诱导HepG2细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

主要试剂 高糖DMEM、胎牛血清购自美国Biological Industries公司；胰酶购自美国Wisent Inc公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海Bestbio生物公司；CCK-8试剂盒购自日本DOJINDO公司；Elk1、磷酸化Elk1、Akt、磷酸化Akt、p44/42 MAPK (ERK1/2)、磷酸化p44/42 MAPK (ERK1/2)、EGR1、磷酸化IGF-1R抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin、HRP偶联抗兔和小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；24孔板购自美国NEST公司；0.5%结晶紫染色液、PBS缓冲液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.2

细胞株的培养 人源HCC细胞株HepG2购自美国American Type Culture Collection公司，以2×10个/ml密度接种于细胞培养瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM置于5% CO、37 ℃培养箱中培养。

1.2 方法

1.2.1

CCK-8法检测HepG2细胞增殖能力 将对数生长期的HepG2细胞，用胰蛋白酶消化，配制成细胞悬液并调整细胞密度为5×10个/ml。取100 μl细胞悬液接种于96孔板各孔中，5% CO、37 ℃培养至细胞贴壁且融合度为50%～60%后，将不同浓度的IGFBP2(15.6、31.2、62.5、125、250 ng/ml)与 IGF-1(50 ng/ml)加入各孔中，每组设3个复孔。培养48、72 h后，每个孔中分别加入10 μl CCK-8溶液，轻轻敲击培养板混匀，培养箱中孵育1～4 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.2.2

Transwell法检测细胞迁移和侵袭 采用文献中相关方法，将处于对数生长期、融合度为70%～80%且饥饿处理12～24 h的HepG2细胞，消化并计数后，用无血清培养基DMEM重悬细胞并调整细胞密度为2×10个/ml，将含有不同浓度IGFBP2(15.6、31.2、62.5、125、250 ng/ml)与IGF-1(50 ng/ml)的200 μl细胞悬液接种于小室的上室。下室加入600 μl含有10%胎牛血清的培养基，每组设3个复孔进行细胞迁移和侵袭实验。侵袭实验中，预先在上室的底部均匀的铺一层Matrigel, 铺胶过程中避免产生气泡。培养12 h后取出24孔板，用棉签小心擦拭小室内部，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min。0.5%结晶紫染色液染色15 min，PBS清洗3次，自然晾干，正置显微镜拍照计数，一个小室计数5个区域的细胞数，取平均值，一次实验至少计数3个小室。

1.2.3

Western blot 250 ng/ml IGFBP2与50 ng/ml IGF-1联合刺激HepG2细胞0、0.5、1、4、12、24、48 h后收集细胞蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，加入一定量的loading buffer后煮样，10%分离胶，5%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，分离后转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶37 ℃摇床封闭2 h后，一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜8 min×3次后，使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(兔二抗按1∶10 000稀释，鼠二抗按1∶20 000稀释)室温孵育2 h，TBST洗膜8 min×3，化学发光液暗室显影。

2 结果

2.1 IGFBP2对IGF-1诱导HepG2细胞增殖能力的影响

如图1结果显示，刺激细胞48 h后，与对照组(IGF-1单独刺激)相比，15.5、31.2 ng/ml的IGFBP2与IGF-1联合刺激组细胞增殖差异无统计学意义(

P

>0.05)；62.5、125、250 ng/ml的IGFBP2与IGF-1联合刺激组增强HepG2细胞的增殖能力 (

F

=8.32,

P

<0.05)，且具有浓度依赖的特性。刺激细胞72 h后，与对照组(IGF-1单独刺激)相比，不同浓度IGFBP2与IGF-1联合刺激各组可浓度依赖地增强IGF-1诱导HepG2细胞的增殖能力，差异有统计学意义(

F

=13.20,

P

<0.05)。

图1 不同浓度IGFBP2与IGF-1联合刺激对HepG2细胞增殖能力的影响

2.2 IGFBP2对IGF-1诱导HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响

与对照组相比，用不同浓度(15.6、31.2、62.5、125、250 ng/ml)IGFBP2与IGF-1联合刺激HepG2细胞12 h后可浓度依赖地增加迁移的细胞数目(图2A)，差异有统计学意义(

F

=113.3,

P

<0.05)(图2B)；细胞侵袭数目统计结果表明，与对照组相比，不同浓度IGFBP2(15.6、31.2、62.5、125、250 ng/ml)与IGF-1联合刺激HepG2细胞12 h后可浓度依赖地增加侵袭的细胞数目(图2C)，差异有统计学意义(

F

=81.1,

P

<0.05)(图2D)。

2.3 IGFBP2与IGF-1联合刺激活化胞内Akt、ERK信号通路

选用250 ng/ml IGBP2与50 ng/ml IGF-1联合刺激HepG2细胞0、0.5、1、4、12、24、48 h, Western blot检测胞内信号通路相关蛋白的活化和表达。结果显示，与0 h(50 ng/ml IGF-1单独刺激)相比，IGF1R的磷酸化水平逐渐增高，并在刺激4 h时达到峰值(

P

<0.05)随后逐步降低；与对照组(IGF-1单独刺激)相比，Akt和ERK的磷酸化水平在联合刺激0.5 h时增高(

P

<0.05)，随着时间的延长逐渐降低，而总表达无明显改变；联合刺激不同时间EGR1的蛋白表达水平也逐渐增高(图3)。以上结果表明，IGFBP2与IGF-1联合刺激活化HepG2细胞内Akt、ERK信号通路，上调EGR1的蛋白表达。

3 讨论

肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭是恶性肿瘤重要的生物学行为。研究表明 IGFBP2的异常表达与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭关系密切。在涎腺性囊性癌中，上调IGFBP2的表达可以增强肿瘤细胞的侵袭迁移能力；IGFBP2通过激活NF-κB信号通路促进胰腺癌细胞侵袭；上调IGFBP2的表达增强HCC细胞株Huh7的迁移侵袭能力。然而，IGFBP2对IGF-1诱导HepG2增殖、迁移和侵袭能力的影响尚不清楚。该研究选用不同浓度IGFBP2与IGF-1联合刺激HepG2细胞，用CCK-8法和transwell法检测细胞功能,结果表明IGFBP2可以增强IGF-1诱导HepG2细胞增殖、迁移和侵袭的能力。

图2 不同浓度IGFBP2与IGF-1联合刺激对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响

图3 250 ng/ml IGFBP2 与50 ng/ml IGF-1联合刺激不同时间对胞内Akt及ERK信号通路活化的影响

Akt及ERK信号通路的活化与肿瘤的发生发展密切相关。研究已证实IGF-1可以通过与IGF1R结合活化Akt及ERK信号通路增强HCC的迁移和侵袭能力。本研究中，用Western blot法检测胞内IGF1R、Akt及ERK蛋白表达，结果显示IGF1R在刺激4 h时磷酸化水平增高，而在刺激0.5 h时Akt及ERK信号通路已被活化，提示IGFBP2增强IGF-1诱导的HepG2细胞增殖、迁移和侵袭可能是通过IGF-1非依赖途径活化Akt及ERK信号通路进行的。研究报道IGFBP-2可通过自身RGD结构与integrin β1受体结合活化ERK 信号通路促进胶质瘤细胞增殖和侵袭；在卵巢癌中，IGFBP2可以通过激活ERK1/2和JNK信号通路促进癌细胞增殖。因此，IGFBP2活化Akt及ERK信号通路的具体机制还需要进一步研究。

EGR1是即刻早期基因家族的重要成员，可被其上游如Akt或ERK等信号通路激活，被活化后可以通过调控其下游靶标基因在肿瘤恶性生物学行为中发挥重要作用。如在前列腺癌中，EGR1通过与IGF1R基因结合上调IGF1R的表达，从而激活Akt及ERK信号通路，最终增强癌细胞的增殖能力；在肝癌中，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HCF)可以诱导EGR1表达及转录，EGR1通过转录激活下游MMP-2和MMP-9基因表达从而促进HCC细胞迁移和侵袭。本研究证明IGFBP2与IGF-1联合刺激HepG2细胞可以上调EGR1的表达，增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力，为探究HCC分子机制提供新的方向。