莫诺苷介导Nrf2通路对HIBI模型大鼠的抗氧化和神经保护作用

李江涛，尹永锋，王润青，张 平，赵 杰，刘荣丽，陈园园

低氧缺血性脑病是由于脑缺氧或缺血引起脑损伤，从而导致意识改变、肌张力变化，常引起诸如脑瘫、癫痫等后遗症。其中血管性痴呆(vascular dementia,VD)是一种由大脑低氧缺血引发的脑血管疾病，会损伤患者的学习和记忆，常伴随着运动失调、语言能力受损及人格障碍。阿尔茨海默病(alzheimer disease,AD)有约15%的患者会发生VD。山茱萸，中医称为“山珠玉”，莫诺苷是其主要活性成分，长期以来一直被用于治疗脑血管疾病和糖尿病。莫诺苷具有抗氧化应激、改善微血管循环、抗细胞凋亡和神经修复功能等多种生物活性。然而，莫诺苷对低氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain injury, HIBI)与转录因子NF-E2相关因子(Nrf)通路的相关性研究尚无报道。该文采用Rice法建立HIBI大鼠模型，探讨莫诺苷是否能够通过介导Nrf通路对HIBI模型产生正面影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

60只SPF级雄性SD大鼠，体质量240～280 g，中国科学院实验动物中心提供。莫诺苷(纯度≥98.0%，美国SIGMA公司)，水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂公司)，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色试剂盒(南京凯基生物有限公司)，化学发光液(密理博中国有限公司)，蛋白抽提试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白测定试剂盒(北京索莱宝生物有限公司)，B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X(Bcl2-associated X,Bax)、半胱天冬酶3(Caspase-3)、Caspase-9、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、突触后致密蛋白95(postsynaptic density-95,PSD95)、海马突触素(synaptophysin,SYP)、转录因子NF-E2相关因子2[transcription factor nuclear factor erythroid 2(NF-E2)-related factor 2,Nrf2]和血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)一抗、二抗(英国Abcam公司)，超氧化物歧化酶(reactive oxygen species,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)。

1.2 主要仪器

电泳仪及半干转膜仪、化学发光凝胶成像系统(美国伯乐公司)，超低温冰箱(美国THERMO公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.3 方法

1.3.1

分组、造模及给药 适应性喂养大鼠1周，并于手术前禁食12 h，禁水4 h。大鼠随机均分为对照组、模型组、尼莫地平组及莫诺苷(25、50、100 mg/kg)组。采用Rice法建立HIBI模型。实验方法具体步骤如下：10%水合氯醛腹腔注射，对大鼠进行麻醉，仰卧姿势固定大鼠，从颈正中处切口找出左颈总动脉，4-0手术线对结扎血管，之后将皮肤缝合。术后2 h，在密闭环境中，37 ℃、8% O+92%N混合气体低氧处理2.5 h。对照组大鼠在相同部位切开处理后即缝合皮肤，不作其他处理。缺血缺氧处理完成后，模型组大鼠通过灌胃给予以25、50、100 mg/kg莫诺苷或者4 mg/kg阳性药尼莫地平，每日1次，连续28 d；对照组和模型组给予相同体积的生理盐水进行灌胃。

1.3.2

神经功能评分 Bederson法评价大鼠神经功能。0分:无神经功能损伤；1分:对侧腕、肘屈曲，肩内收屈曲；2分：在1分指标的基础上，同时发生了前肢抵抗对侧推力下降；3分：对侧转圈。

1.3.3

脑积水检测及脑组织取材 神经功能评分完成后，断颈处理，迅速取脑组织，测量各组大鼠脑积水量后，将脑组织置于PBS中预冷5 min，4%多聚甲醛进行固定，分装后保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3.4

HE染色 取双侧端脑前2/3，切片后行HE染色。

1.3.5

ELISA检测SOD、MDA及LDH水平 取脑组织相同部位进行匀浆处理，在4 ℃、3 000 r/min条件下离心25 min，收集上清液，按照试剂盒的步骤，检测SOD、MDA和LDH含量。

1.3.6

Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、bFGF、BDNF、PSD95、SYP、Nrf2和HO-1表达 取大鼠双侧脑后1/3部分，等比例加入含蛋白抑制剂的裂解液，提取各组总蛋白。BCA定量后加Loading buffer煮沸变性，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白并转至PVDF膜，5%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)室温封闭1h后一抗4 ℃孵育过夜，次日用Tri盐酸+吐温缓冲盐溶液(Tris-HCl+Tween,TBST)进行洗涤，重复3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST缓冲液洗涤，重复3次，加入电化学发光试剂(electrochemiluminescence,ECL)进行显影，凝胶成像仪分析结果，实验以β肌动蛋白(β-actin)作为内参。

2 结果

2.1 大鼠神经功能和脑积水检测

相比对照组，模型组大鼠神经功能学评分高于2分 (

q

=22.15,

P

<0.01)，表明成功建立了HIBI模型；与模型组比较，经过25、50、100 mg/kg剂量莫诺苷治疗的大鼠神经功能评分均降低(

P

<0.01)，并具有剂量依赖性，差异有统计学意义(

F

=58.47,

P

<0.01)。见图1A。同时，与对照组比较，模型组大鼠脑积水量增加(

P

<0.01)，经过25、50、100 mg/kg剂量莫诺苷的治疗，相比于模型组，脑积水量下降，差异有统计学意义(

P

<0.01)，且与莫诺苷给药剂量呈反比(

F

=48.78,

P

<0.01)。见图1B。提示莫诺苷能剂量依赖性地减轻HIBI诱导的大鼠神经功能损伤，同时HIBI大鼠脑积水量降低。

2.2 莫诺苷改善HIBI模型大鼠脑组织病理改变

对照组脑组织细胞排列规则、轮廓清晰且结构完整；模型组可见细胞呈弥漫性分布，排列紊乱疏松、空泡化增加，且可见炎性浸润现象；而与模型组相比，莫诺苷25、50、100 mg/kg组和尼莫地平组治疗28 d后细胞密度增加、排列整齐，脑组织病理改变减少。提示莫诺苷能有效改善HIBI模型大鼠的脑组织病理改变。见图2。

2.3 大鼠脑组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达水平

相比对照组，模型组大鼠脑组织高表达Bax、Caspase-3和-9蛋白，低表达Bcl-2蛋白(

P

<0.01)；同时，与模型组相比，莫诺苷25、50 、100 mg/kg组和尼莫地平组上述蛋白的表达趋势有了逆转(

P

<0.01)，且呈莫诺苷剂量依赖性。莫诺苷可抑制HIBI诱导的促凋亡蛋白表达同时促进抗凋亡蛋白表达(Bcl-2:

F

=164.8；Bax:

F

=162.6；Caspase-3:

F

=389.1；Caspase-9:

F

=203.2；

P

均<0.01)。见图3。

图1 大鼠神经功能评分和脑积水量检测结果

图2 大鼠脑组织 HE×400

图3 大鼠脑组织凋亡蛋白表达情况

图4 MDA、SOD和LDH检测结果

2.4 MDA、SOD和LDH检测

与对照组的MDA、SOD和LDH水平比较，模型组脑组织中SOD活性下降(

P

<0.01)，MDA和LDH水平上升(

P

<0.01)；莫诺苷治疗28 d后，与模型组比较，莫诺苷25、50、100 mg/kg剂量组大鼠脑组织中SOD水平剂量升高(

P

<0.01)，同时莫诺苷25、50、100 mg/kg组的MDA水平下调，莫诺苷25、50、100 mg/kg组的LDH水平下调(

P

<0.01)。这说明莫诺苷提高了HIBI大鼠脑组织SOD水平，降低MDA和LDH水平，变化趋势具有剂量依赖性(SOD:

F

=50.50；MDA:

F

=117.8；LDH:

F

=35.13；

P

<0.01)。见图4。

2.5 bFGF、BDNF、PSD95和SYP检测

Western blot检测各组脑组织蛋白表达，相比对照组，模型组大鼠脑组织中bFGF、BDNF、PSD95和SYP的蛋白表达水平降低(

P

<0.01)；莫诺苷治疗28 d后，与模型组相比，莫诺苷25、50、100 mg/kg剂量组大鼠上述指标呈莫诺苷浓度依赖性上调(

P

<0.01)。莫诺苷具有逆转HIBI诱导的bFGF、BDNF、PSD95和SYP蛋白表达下调的作用(bFGF:

F

=131.6; BDNF:

F

=174.4; PSD95:

F

=436.2; SYP:

F

=346.2;

P

<0.01)。见图5。

2.6 Nrf2和HO-1检测

Western blot法对各组大鼠脑组织Nrf2和HO-1表达进行检测，相比对照组，模型组大鼠脑组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平均下调(

P

<0.01)；莫诺苷治疗28 d后，莫诺苷25、50、100 mg/kg剂量组大鼠上述指标较模型组均上调(

P

<0.01)，且与莫诺苷给药剂量呈现相关性。结果表明，莫诺苷能正向调节HIBI诱导的抗氧化相关通路蛋白Nrf2、HO-1表达水平下调(Nrf2:

F

=448.9; HO-1:

F

=442.6;

P

<0.01)。见图6。

图5 bFGF、BDNF、PSD95和SYP检测结果

图6 Nrf2和HO-1检测结果

3 讨论

AD是一种以记忆和认知渐进性障碍为特征的神经系统退行性疾病，治疗主要是通过影响突触传递，降低兴奋性氨基酸对胆碱能神经的毒害等方式，仅可缓解认知减退，发挥的作用十分有限，因此需要寻找更为有效的治疗新方法。研究表明莫诺苷的抗氧化应激、改善微血管循环及神经修复等功能均可能决定了其在脑损伤保护方面的潜在作用。Nrf2信号通路在机体对抗病原入侵和氧化应激损伤的过程中发挥着不可替代的作用。本文拟采用Rice法建立HIBI大鼠模型，并通过莫诺苷灌胃治疗HIBI大鼠，以研究莫诺苷对HIBI的抗氧化和神经保护作用。

该研究采用了Bederson法评价大鼠神经功能，表明HIBI模型会使大鼠的神经功能评分升高，主要神经症状表现为对侧腕、肘屈曲，肩内收屈曲等，并且引起脑积水量增加。神经功能评分和脑积水量增加是HIBI最为直观的表现，证明HIBI模型复制成功。而灌胃给予不同浓度莫诺苷治疗28 d后表明HIBI可降低大鼠神经功能评分，同时减少脑积水量，呈剂量依赖性。说明莫诺苷可减轻HIBI模型大鼠的神经功能损伤，减少脑积水；与Liu et al研究相符。进一步研究显示莫诺苷有效抑制Bax、Caspase-3和Caspase-9，促进Bcl-2蛋白表达，并减少HIBI引起的神经元细胞凋亡，减轻大鼠脑组织的病理学改变。此外，莫诺苷还能调节SOD、MDA和LDH活性/含量以发挥抗氧化功能。脑组织低氧缺血损伤会产生大量活性氧、自由基等物质，从而引起线粒体质膜脂质过氧化，最终引起细胞凋亡。在大脑中动脉闭塞模型中，莫诺苷能通过减少氧化应激反应和抗细胞凋亡来保护缺血/再灌注诱导的脑损伤。在脑组织低氧缺血损伤中，莫诺苷很可能通过相同的机制发挥脑组织保护作用。此外，本研究还显示莫诺苷能剂量依赖性地逆转HIBI诱导的bFGF、BDNF、SYP和PSD95的低表达。 bFGF和BDNF同属于神经营养因子家族，可减轻神经元损伤诱发的神经变性，改善记忆，在AD脑组织修复中发挥着重要作用。SYP和PSD95也被证明与认知功能障碍相关。因此，莫诺苷可通过促进bFGF、BDNF、SYP和PSD95表达，促进脑组织修复，从而减轻脑组织低氧缺血损伤引起的神经变性。

转录因子Nrf2在生理条件下与Keapl以非活性状态结合于胞质内；当受到环境因素刺激而被激活时，Keapl降解并释放出Nrf2，再经过核转运入核，提高GST、HO-1和NQO1等抗氧化基因表达，从而抵抗氧化应激，维持细胞的氧化还原平衡。周玉燕 等研究表明，莫诺苷能通过调节氧化应激通路相关蛋白Nrf2和HO-1表达，介导Nrf2通路对雷公藤甲素造成的肝损伤起到有效的保护作用。本研究也得到了相似的结果，Nrf2/HO-1通路受莫诺苷影响上调，提升了HIBI模型大鼠的抗氧化能力，具有剂量依赖性，这一作用减轻了氧化应激损伤，也从另一方面解释了HE染色观察到的组织病理学改变。