基因干扰lncRNA SPRY4-IT1对GBC-SD细胞干样性及线粒体膜电位的影响

李 辰，王庆治，歧红阳，毛建娜，魏小娟，王鹏立，董志超

胆囊癌(gallbladder cancer, GBC)是胆道恶性肿瘤的一种，是全球发病率排名第五的胃肠道恶性肿瘤。早期GBC患者往往无症状，就诊时多为晚期。因此，需要一种新的肿瘤靶标，以提高GBC患者的诊断、预后判断和治疗。近年来，研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNAs)为基因表达的关键调控因子，在许多人类肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用。快速发育生长因子同源蛋白4内含子转录本1(sprouty homolog 4 intronic transcript 1, SPRY4-IT1)为快速发育生长因子同源蛋白4(sprouty homolog 4, SPRY4)基因内的一个内含子，在各种癌症中被证明是癌症发生发展的调节枢纽。近期研究表明，lncRNA SPRY4-IT1的上调与乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌等肿瘤的进展及不良预后相关。此外，lncRNA SPRY4-IT1的下调可抑制胶质瘤的细胞增殖、细胞凋亡、转移和上皮-间质转化。然而，尚未见lncRNA SPRY4-IT1对GBC的影响及作用机制，该研究通过基因干扰lncRNAs SPRY4-IT1, 探究其对GBC细胞GBC-SD肿瘤干细胞样特性及线粒体膜电位变化的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

DMEM培养液、胎牛血清、胰酶、Lipofectamine 3000试剂(美国Invitrogen公司)；二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid，BCA) 蛋白定量试剂盒(美国PIERCE公司)；Super RT cDNA试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)；ELISA BrdU (比色) 试剂盒(瑞士罗氏公司)；Matrigel底膜基质(美国BD公司)；Sry相关HMG盒2(Sry-related HMG box 2, SOX2)、八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4, OCT4)、CD44、半胱天冬酶3(Caspase-3)、Caspase-9、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2, associated X, Bax)、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)、c-Myc抗体(美国NEB公司)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的山羊抗小鼠二抗(美国Santa Cruz公司)；细胞凋亡检测试剂盒 (Annexin PE/7-AAD) (南京凯基生物有限公司)；高速低温离心机(美国Beckman公司)；CO培养箱(美国Thermo公司)；电泳槽、电转仪、ChemiDoc XRS 凝胶/发光图像分析仪(美国Bio-Rad公司)；电热恒温水浴箱(上海医疗器械七厂)；凝胶成像系统GDS-800 UVP(美国UVP公司)；流式细胞仪 (美国Becton-Dickinson公司)；shRNA-SPRY4-IT1(广州锐博生物有限公司)。

1.2 细胞培养

GBC-SD细胞由中科院上海细胞库提供，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中生长。所有细胞均在含有5%CO的培养箱中37 ℃培养，细胞汇合率达到85%以上时用0.25%胰酶进行消化传代。

1.3 实验方法

1.3.1

细胞转染 将GBC-SD细胞传代培养于6孔板中。培养24 h后根据转染试剂盒说明书用Lipofectamine 3000将Scarmble组细胞转染与shRNA-SPRY4-IT1基因无同源性的shRNA作为阴性对照，shRNA-SPRY4-IT1组细胞转染shRNA-SPRY4-IT1，48 h后进行相应检测。

1.3.2

RT-PCR 使用TRIzol试剂提取总RNA，并通过超微紫外光分光光度计在260和280 nm处测定吸光度。按照Super RT cDNA试剂盒说明书配制反应体系，振荡混匀，短暂离心，使关闭溶液收集至管底，反转录合成cDNA，反应条件42 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min，短暂离心，冰上冷却。 此外，使用QuantifastSYBRGreenPCR Kit进行PCR，反应条件为95 ℃、15 s和60 ℃、60 s。用于该反应的引物序列如下：SPRY4-IT1：上游5′-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3′, 下游5′-CGATGTAGTAGGATTCCTTTCA-3′；GAPDH：上游5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′, 下游5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。

1.3.3

BrdU染色 细胞增殖测定采用细胞增殖ELISA BrdU (比色) 试剂盒根据说明书转染48 h后，1.0×10个/孔加入到96孔的培养皿中，并让其附着过夜。细胞用BrdU标记2 h，固定，用抗BrdU-pod孵育。通过洗涤去除未结合的过氧化物酶偶联物。然后加入底物，15 min后测量 (370 ～492 nm)吸光度值。

1.3.4

流式细胞术 采用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒对GBC-SD细胞凋亡进行分析和测量。用不同浓度的二氢杨梅素或二甲基亚砜作对照，在6孔板中以3×10个/孔的密度培养48 h。细胞用冷PBS冲洗3次，然后用100 μl结合缓冲液处理。然后用3 μl Annexin V-FITC和10 μl 碘化丙啶孵育20 min。采用流式细胞仪进行细胞凋亡。

1.3.5

成球实验检测肿瘤干细胞样特性 收集对数生长期的GBC-SD细胞，用DMEM培养基洗1次并重悬，血细胞计数器计数细胞密度。在6孔板中加含2% B27、20 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和20 ng/ml表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)的DMEM/ F12培养基，每孔接种1 000个细胞，置于5% CO恒温培养箱中。每隔2 d补加新鲜培养基，转染shRNA-SPRY4-IT1处理14 d，于倒置显微镜下拍照并统计成球直径和成球率。

1.3.6

Western blot实验 使用RIPA裂解缓冲液裂解各组细胞样品，在6孔板中每孔加入250 μl裂解液，用枪吹打均匀使细胞与裂解液充分接触裂解。然后，使用BCA蛋白质测定试剂盒定量蛋白质浓度。含有20 mg蛋白质的样品在10%SDS-PAGE中分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗 (SOX2, 1∶1 000; OCT4, 1∶1 000; CD44, 1∶1 000; Caspase-3, 1∶1 000; Caspase-9, 1∶1 000; Bax, 1∶1 000; Bcl-2, 1∶1 000; c-Myc, 1∶1 000)于4 ℃封闭过夜，第2天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL,设置曝光参数，检测目的条带对应化学发光强弱。

2 结果

2.1 干扰SPRY4-IT1表达对GBC细胞增殖的影响

RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，shRNA-SPRY4-IT1组SPRY4-IT1的表达水平降低 (

F

=317.6，

P

<0.05) 。见图1。BrdU染色结果显示，与对照组比较，shRNA-SPRY4-IT1组BrdU阳性细胞数减少(

F

=83.62，

P

<0.05) 。

2.2 干扰SPRY4-IT1表达对GBC细胞凋亡的影响

流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示，3组细胞凋亡率见图2A。与对照组比较，shRNA-SPRY4-IT1组GBC-SD细胞凋亡率升高 (

F

=60.42，

P

<0.05)。见图2B。

2.3 干扰SPRY4-IT1表达对GBC干细胞特性的影响

干扰SPRY4-IT1表达，形成的GBC-SD细胞微球的体积和数量减少。见图3。与对照组比较，shRNA-SPRY4-IT1组肿瘤干细胞成球率降低 (

F

=17.84，

P

<0.05)，成球直径减小(

F

=49.42，

P

<0.05)。见表1。

2.4 干扰SPRY4-IT1表达对SOX2、OCT4、CD44的表达的影响

从Western blot条带中可以看出，shRNA-SPRY4-IT1组SOX2、OCT4、CD44蛋白表达量较对照组降低。见图4。Western blot灰度分析，与对照组比较，shRNA-SPRY4-IT1组SOX2、OCT4、CD44蛋白表达水平均降低(

P

<0.05)。见表2。

图1 GBC细胞中SPRY4-IT1的表达水平以及GBC细胞的增殖变化

图2 GBC-SD细胞的凋亡变化

图3 成球实验检测肿瘤干细胞样特性 ×400

表1 各组肿瘤干细胞成球率和成球直径的变化

2.5 干扰SPRY4-IT1表达对线粒体膜电位的影响

正常GBC-SD细胞经染色后发出红色荧光，表示线粒体膜电位完整。与对照组比较，shRNA-SPRY4-IT1组线粒体膜电位升高 (

F

=230.7，

P

<0.05)。见图5。

2.6 干扰SPRY4-IT1表达对线粒体损伤标志物蛋白表达的影响

如图6所示，Western blot条带显示，shRNA-SPRY4-IT1组cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax蛋白表达量较对照组升高；Bcl-2和c-Myc蛋白表达量较对照组降低。Western blot灰度分析结果见表3，与对照组比较，shRNA-SPRY4-IT1组cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax/Bcl-2蛋白表达水平均升高(

P

<0.05)；c-Myc蛋白表达水平降低(

P

<0.05)。

图4 不同组SOX2、OCT4、CD44蛋白表达量

图5 不同组GBC细胞线粒体膜电位变化

表2 不同组SOX2、OCT4、CD44蛋白表达水平变化

表3 不同组Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、c-Myc蛋白表达水平变化

图6 不同组Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、c-Myc的蛋白表达量

3 讨论

lncRNAs是ncRNAs家族中重要的新成员，被认为是与癌症进展相关的各种肿瘤的关键介质。研究显示lncRNA在促进人类恶性肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用，包括细胞生长、细胞凋亡、细胞周期分布和癌症转移。最近一项研究报道称，SPRY4-IT1在GBC组织中高表达，SPRY4-IT1对细胞迁移和侵袭的抑制作用部分与上皮间质转化过程有关。但是干扰SPRY4-IT1表达在GBC中的功能作用尚未被阐明。在本研究中，通过基因干扰lncRNAs SPRY4-IT1来研究其对GBC细胞GBC-SD肿瘤干细胞样特性及线粒体膜电位变化的影响。

细胞增殖是恶性肿瘤细胞具有无限增殖能力的关键因素。同样，在GBC的研究中，Yang et al研究发现在GBC组织中SPRY4-IT1表达上调，进一步的实验表明SPRY4-IT1的下调抑制了GBC细胞的增殖。与Yang et al研究结果一致，本研究显示干扰SPRY4-IT1表达后，绿色阳性细胞数减少，表明干扰SPRY4-IT1表达能抑制GBC细胞GBC-SD的增殖。

lncRNASPRY4-IT1从SPRY4基因的第2个内含子转录并调节细胞的凋亡。线粒体膜去极化引起的线粒体膜电位的下降，在凋亡信号的刺激下，线粒体膜电位的下降必然引起凋亡。本研究显示干扰SPRY4-IT1表达，线粒体膜电位降低，表明干扰SPRY4-IT1表达可诱导GBC细胞凋亡。c‐MYC癌基因是在包括GBC在内的人类癌症发展过程中最常见的激活癌基因之一。在凋亡过程中，细胞色素C是凋亡小体形成所必需的，并由此激活procaspase-9，而procaspase-9又裂解并激活下游效应因子Caspase-3，进而导致最终的细胞凋亡。Yao et al研究发现敲除SPRY4-IT1、Bcl-2的蛋白表达受到抑制，Caspase-3、Caspase-9、Bax的蛋白表达增加，促进PDAC细胞的凋亡。本研究显示干扰SPRY4-IT1表达引起c-Myc蛋白表达水平降低；促进GBCGBC-SD细胞凋亡，增高cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax/Bcl-2蛋白表达，表明干扰SPRY4-IT1表达可调控凋亡相关蛋白的表达，从而促进GBC细胞凋亡。

干细胞被认为是少数几个具有失控增殖特征的癌细胞之一，包括自我更新、多潜能分化和干细胞特征。CD44是肿瘤的细胞表面标志物，被用来识别肿瘤干细胞，这些肿瘤干细胞已被证明在肿瘤进展和不良预后中起重要作用。OCT4与胚胎干细胞和生殖细胞中观察到的多能性、增殖潜能和自我更新特性有关。SOX2对胚胎干细胞和神经前提细胞的自我更新维持至关重要。研究表明SOX2在许多恶性肿瘤中过表达，并与肿瘤的分化和进展相关。此外，SOX2蛋白与OCT4结合，调控DNA转录和干细胞特性，两者在基因调控中发挥重要作用，对胚胎发生以及细胞的多能性和自我更新至关重要。然而，肿瘤干细胞在GBC中的作用尚无研究。本研究显示干扰SPRY4-IT1表达减小肿瘤成球直径，降低肿瘤干细胞成球率以及SOX2、OCT4、CD44蛋白表达水平，表明干扰SPRY4-IT1表达能降低肿瘤干细胞特性，抑制GBC的发展，但具体的作用机制有待进一步的研究。