淫羊藿苷介导Nrf2/HO-1信号通路减轻大鼠肾缺血再灌注损伤和氧化应激

牟俊杰，冯 静，张文松，关 欣，陈 琴，蒋飞飞，甘 措，刘 瑶，邓 菲

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是全球范围内急性期死亡和残疾的常见原因之一，给医疗保健系统带来了重大的疾病负担。肾缺血再灌注是急性肾损伤的主要原因，通过影响各种细胞因子的炎症活性和活性氧的产生及细胞凋亡加剧肾脏损害。随着肾脏缺血再灌注的重要性越来越明显，开发新的治疗方法来预防缺血再灌注引起的肾脏损害非常有必要。

淫羊藿苷是中药淫羊藿的主要活性成分，具有抗肿瘤、改善心脑血管、促进骨组织功能、提高免疫等作用。相关研究表明，淫羊藿苷可通过对抗氧化应激或抑制诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)酶表达及其下游的炎症级联反应改善肾脏缺血再灌注损伤。但淫羊藿苷对肾缺血再灌注损伤的具体作用分子仍尚不清楚。该文旨在探究淫羊藿苷对肾缺血再灌注大鼠病理损伤和氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只SD大鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司，雄性，7周龄，体质量(210±12)g，许可证号：SCXK(苏)2016-0010。置于12 h/12 h明暗循环动物设施中常规饲养7 d。

1.2 实验药物和主要试剂

淫羊藿苷(110737-201516)购自中国食品药品检定研究院，化学式：C33H40O15，分子量：676.65，纯度≥94.2%。苏木精-伊红染液(D006-1-1)、尿蛋白定量测试盒(C035-2-1)、肌酐测定试剂盒(C011-2-1)、尿素氮测试盒(C013-2-1)、总超氧化物歧化酶测定试剂盒(A001-3-2)、谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒(A005-1-2)购自南京建成生物工程研究所；iNOS ELISA试剂盒(JK-a-1607)、IL-10 ELISA试剂盒(JK-a-5026)购自上海晶抗生物工程有限公司；Anti Caspase-3(ab13847)、cleaved Caspase-3(ab2302)、Caspase-9(ab52298)、cleaved Caspase-9(ab2324)、Bax(ab53154)、Bcl-2(ab196495)、Nrf2(ab31163)、p-Nrf2(ab76026)、HO-1(ab13243)、GAPDH(ab9485)购自英国Abcam公司。

1.3 动物模型建立与分组

采用随机数字表法将大鼠随机分为5组：Control组、RIRI组、RIRI+icariin 25 mg/kg组、RIRI+icariin 50 mg/kg组和RIRI+icariin 100 mg/kg组，每组12只。参照Zhang et al方法建立肾缺血再灌注大鼠模型，麻醉所有大鼠，对所有大鼠进行中线剖腹手术和右肾切除术，暴露左肾，Control组不做处理，其余各组用非创伤性血管钳夹紧左肾动脉，诱导缺血1 h，松开动脉后，再灌注24 h。缝合切口后RIRI+icariin 25 mg/kg组、RIRI+icariin 50 mg/kg组和RIRI+icariin 100 mg/kg组分别灌胃淫羊藿苷25、50、100 mg/kg，Control组和RIRI组灌胃等量生理盐水，每天1次，连续7 d，7 d后处死各组大鼠。

1.4 肾功能指标

收集各组大鼠尿液、血液，用全自动生化分析仪检测尿液中蛋白尿含量，用分离后的血清用全自动生化分析仪检测肌酐酸、尿素氮水平。

1.5 HE染色

取各组大鼠肾组织先用10%甲醛固定48 h，然后石蜡包埋制作呈切片，切片5 mm厚。然后用苏木精-伊红染色。在400×荧光显微镜下观察肾组织损伤情况。

1.6 ELISA检测外周血和肾组织中iNOS、IL-10含量

按照iNOS、IL-10 ELISA试剂盒说明书进行双抗夹心酶联免疫法检测，在4 ℃下用50 mmol/L的碳酸盐包被缓冲液溶解抗原，100 μl/孔到96孔酶标板，将抗原包被过夜，弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次5 min，每孔加150 μl 1%BSA封闭1 h，PBST洗涤3次，加入100 μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃孵育2 h，PBST洗涤5次，加入100 μl稀释后的HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5次后显色剂显色20 min，于450 nm处酶标仪测定吸光度(optical density,OD)。

1.7 氧化应激指标

按照试剂盒说明书，采用酶标仪测定总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量，采用可见分光光度计测定谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione，GSH)含量。SOD在450 nm处测OD值，GSH在412 nm处测OD值。

1.8 Western blot

收集各组大鼠肾组织细胞并在冰上溶解25 min。用BCA试剂盒提取总蛋白并测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品，100 ℃变性5 min。SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，在4 ℃条件下加入相应一抗并孵育过夜，清洗，然后在4 ℃下加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。ImageJ软件统计灰度值。

2 结果

2.1 淫羊藿苷降低肾缺血再灌注大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平

通过试剂盒检测各组大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平，结果如图1所示，与Control组比较，RIRI组大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平升高(

t

=1.571、1.941、1.813，

P

<0.05)。与RIRI组比较，RIRI+icariin 50、100 mg/kg组大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平降低(

F

=16.67、9.882、11.79，

P

<0.05)。

图1 淫羊藿苷对肾缺血再灌注大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平的影响

图2 淫羊藿苷对肾缺血再灌注大鼠病理损伤程度的影响 HE染色×400

2.2 淫羊藿苷改善肾缺血再灌注大鼠病理损伤程度

通过HE染色检测各组大鼠肾组织病理损伤结果。如图2所示，Control组大鼠肾脏组织结构和肾小球细胞形态均未见异常，RIRI组和RIRI+icariin 25 mg/kg组肾组织病理改变明显，肾小球数量减少，肾小管水肿、扩张，空泡化，炎性细胞浸润，纤维化，细胞充血，部分区域可见蛋白管型，表现出明显的肾组织病理损伤；RIRI+icariin 50、100 mg/kg组较RIRI组病理损伤程度明显改善。

2.3 淫羊藿苷降低肾缺血再灌注大鼠cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/ Caspase-9、Bax/Bcl-2比值

Western blot检测各组大鼠肾组织Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表达水平结果如图3所示，与Control组比较，RIRI组cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/ Caspase-9、Bax/Bcl-2比值升高(

t

=1.000、1.091、1.009，

P

<0.05)。与RIRI组相比较，RIRI+icariin 50、100 mg/kg组cleaved Caspase-3/ Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2比值降低(

F

=124.5、38.05、272.6，

P

<0.05)。

2.4 淫羊藿苷降低肾缺血再灌注大鼠外周血和肾组织中iNOS含量，升高IL-10含量

通过ELISA检测外周血和肾组织中iNOS、IL-10含量，结果如图4所示，与Control组比较，RIRI组外周血和肾组织中iNOS、IL-10含量升高(

t

=1.320、3.400、1.288、3.667，

P

<0.05)。与RIRI组比较，RIRI+icariin 50、100 mg/kg组iNOS含量降低(

F

=11.50、18.50，

P

<0.05)，IL-10含量升高(

F

=16.00、22.14，

P

<0.05)。

2.5 淫羊藿苷升高肾缺血再灌注大鼠SOD、GSH含量和Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表达水平

通过试剂盒检测各组大鼠肾组织SOD和血清GSH含量结果，如图5所示，与Control组比较，RIRI组SOD、GSH含量降低(

t

=3.600、1.960，

P

<0.05)。与RIRI组比较，RIRI+icariin 50、100mg/kg组SOD、GSH含量升高(

F

=4.425、10.99，

P

<0.05)；Western blot检测各组大鼠Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表达水平结果如图5所示，与Control组比较，RIRI组p-Nrf2/ Nrf2比值和HO-1蛋白水平降低(

t

=1.118、1.048，

P

<0.05)。与RIRI组比较，RIRI+icariin 50、100mg/kg组p-Nrf2/ Nrf2比值和HO-1蛋白水平升高(

F

=22.62、50.36，

P

<0.05)。

图3 淫羊藿苷对肾缺血再灌注大鼠Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响

3 讨论

肾缺血再灌注会造成严重的肾损伤，如肾小球滤过率降低，肾小管上皮细胞受损，导致肾小管的重吸收作用减弱。肾缺血再灌注损伤临床表现为血肌酐和尿素氮升高,其次肾脏损伤往往伴随着蛋白尿的产生。本研究表明淫羊藿苷具有降低肾缺血再灌注大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平的作用，提示淫羊藿苷通过改善肾功能改善肾缺血再灌注损伤。

图4 淫羊藿苷对肾缺血再灌注大鼠外周血和肾组织中iNOS、IL-10含量的影响

细胞凋亡是一种由多种基因调控的自主程序性死亡。细胞凋亡在肾缺血再灌注损伤病理生理过程中发挥重要作用，抑制细胞凋亡是治疗肾缺血再灌注损伤重要方式。Caspase家族成员是哺乳动物细胞凋亡的主要蛋白酶家族，在细胞接收凋亡信号后，Caspases凋亡级联被激活，Caspase-9为凋亡启动因子，位于凋亡级联反应上游，在其他蛋白参与下发生自我活化并激活下游凋亡执行因子Caspase-3，导致细胞凋亡。Bax和Bcl-2属于Bcl-2基因家族成员，Bcl-2为凋亡抑制基因，Bax为促凋亡基因，Bax/Bcl-2比值越高，凋亡状况越严重。朱敏杰 等研究发现葛根素通过降低Caspase-3蛋白表达，降低Bax/Bcl-2比值抑制肾缺血再灌注大鼠肾脏组织细胞凋亡、改善肾功能。本文研究显示淫羊藿苷具有降低肾缺血再灌注大鼠cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/ Caspase-9、Bax/Bcl-2比值的作用。提示淫羊藿苷通过抑制细胞凋亡改善肾功能。

图5 淫羊藿苷对肾缺血再灌注大鼠SOD、GSH含量和Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响

氧化应激和炎症反应是导致肾缺血再灌注损伤的重要因素，通过施用药物干预炎症因子的释放和抗氧化应激可有效改善肾缺血再灌注损伤。IL-10是内源性抗炎因子，研究表明IL-10在肾缺血再灌注损伤中含量降低，导致大量炎症因子的释放。iNOS通过催生NO与氧自由基结合成亚硝酸盐，促进脂质过氧化、坏死、凋亡和炎症因子的释放，导致组织损伤加重。SOD和GSH是体内抗氧化作用的防御系统，当氧自由基大量产生时，SOD和GSH消耗用以清除自由基，导致体内SOD和GSH含量降低，SOD和GSH的含量反应几天受氧自由基的损伤程度。本研究显示淫羊藿苷具有降低肾缺血再灌注大鼠外周血和肾组织中iNOS含量，升高IL-10含量，升高肾缺血再灌注大鼠SOD、GSH含量的作用。提示淫羊藿苷通过抑制炎症反应和抗氧化应激改善肾缺血再灌注损伤。

核因子-E2相关因子2是内源性抗氧化防御的关键调控因子之一，可以促进多种抗氧化基因转录，包括血红素氧化酶-1。相关研究表明Nrf2/HO-1信号通路是改善肾损伤的重要通路。Long et al研究发现齐墩果酸通过激活Nrf2通路，发挥抗氧化和抗炎作用，从而改善肾缺血再灌注引发的急性肾损伤。本研究显示淫羊藿苷具有升高Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表达水平的作用。提示淫羊藿苷通过介导Nrf2/HO-1信号通路改善肾缺血再灌注损伤。

综上，淫羊藿苷在肾缺血再灌注损伤中有明显的抗氧化作用，可抑制炎症因子的释放，抑制细胞凋亡，改善肾功能，可能是通过激活Nrf2/HO-1信号通路实现的。本研究为淫羊藿苷临床应用治疗肾缺血再灌注损伤提供了一定实验依据。