ASH2L在上皮性卵巢癌中的表达及其对SKOV-3细胞系增殖的影响

孙 超，孙士莹，詹 磊，卫 兵，王文艳

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，死亡率位于妇科恶性肿瘤首位。表观遗传学的研究对恶性肿瘤的预防和治疗有着重要的意义。有研究表明：组蛋白H3K4甲基化修饰可影响肾癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌及胃癌等多种恶性肿瘤的预后。在哺乳动物体内，混合谱系白血病(mixed lineage leukemia，MLL)甲基转移酶能够参与家族蛋白调节H3K4的组蛋白修饰，而ASH2L是MLL甲基转移酶的核心亚单位之一。ASH2L 的表达缺失，会使MLL复合体进行H3K4三甲基化修饰的水平降低。因此,ASH2L的表达会通过甲基化修饰的途径影响细胞的发生发展及癌变。目前尚无关于ASH2L在卵巢癌中的相关性研究，该研究旨在观察ASH2L在上皮性卵巢癌中的表达及其对卵巢上皮性恶性肿瘤SKOV-3增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

细胞系 人卵巢癌细胞系SKOV-3及人肾上皮细胞系293T(中国科学院上海细胞库)，保存于安徽医科大学第二附属医院中心实验室。细胞系用含有10%的胎牛血清、1%链霉素及青霉素的DMEM培养基培养，置于37 ℃、5% CO和饱和湿度的恒温培养箱中。

1.1.2

标本收集 选取2018年3月—2019年7月因卵巢癌和同期因绝经后子宫良性疾病在安徽医科大学第二附属医院妇科行手术治疗的20例患者为研究对象。卵巢癌患者10例，因子宫良性疾病行子宫双附件切除的患者10例(子宫肌瘤患者6例，子宫腺肌症患者3例，子宫内膜息肉1例)。卵巢癌组患者手术前均未接受辅助化疗；绝经后子宫良性疾病组患者术前未接受性激素治疗。卵巢癌组患者年龄为42～65(52±6.62)岁；子宫良性疾病组患者年龄为50～58(53±2.63)岁。卵巢癌组术后卵巢组织病理均为卵巢浆液性乳头状腺癌。子宫良性疾病组患者术后卵巢病理结果均提示卵巢正常。本研究经安徽医科大学第二附属医院伦理委员会同意。

1.1.3

感受态细胞 DH5α(上海生工生物工程股份有限公司)保存于安徽医科大学第二附属医院中心实验室，置于-80 ℃冰箱中。

1.1.4

主要试剂 ASH2L抗体(美国BETHYL公司)；β-actin多克隆抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、ECL发光试剂盒(美国affinity公司)；PVDF膜(上海Biosharp公司)；胎牛血清、高糖DMEM液体培养基(美国Gibco公司)；免疫组化试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)；ASH2L质粒及空载质粒(美国Addgene公司)；质粒提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司)；jetPRIME®试剂(法国polyplus-transfection公司)；CCK-8试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司)。

1.1.5

主要仪器 Heraeus CO恒温培养箱(德国Heraeus公司)；酶标仪(上海科华实验系统有限公司)；高速低温离心机(美国Eppendorf公司)；CU420型电热恒温水箱(上海恒科仪器有限公司)；电泳仪、显影仪(上海天能科技有限公司)；IMPLEN超微量分光光度计(江苏万科科教仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1

免疫组化 收集上皮性卵巢癌组织，制成石蜡切片并脱蜡，放入修复盒中浸润于柠檬酸抗原修复缓冲液，在微波炉内加温抗原修复，使用3%过氧化氢阻断内源性的过氧化物酶，血清封闭后加入一抗，复温后加入对应的二抗，室温下孵育50 min，滴加链亲和素-过氧化物酶溶液，室温孵育10 min,加入现配的DAB染液，避光约10 min后显微镜观察染色情况。

1.2.2

Western blot实验 提取组织或细胞系的总蛋白，利用BCA法进行蛋白定量，在制好的凝胶板孔中加入样品和Marker，而后依次进行电泳、切胶、转膜。转膜过后，对带有蛋白的PVDF条带依次进行室温下5%脱脂牛奶封闭、洗膜，4 ℃下一抗过夜孵育、洗膜，室温下二抗封闭1 h、洗膜，最后利用显影仪进行ECL显色，并对图像进行处理与分析。

1.2.3

转化及质粒扩增 将质粒样本加入到感受态细胞DH5α中进行转化，接种于LB培养基中并于37 ℃过夜培养，在培养基中挑取单克隆菌落放入含抗生素的LB培养液中37 ℃、200～250 r/min条件下过夜摇菌培养，最后利用质粒提取试剂盒对菌液中的质粒进行提取，并测量浓度。

1.2.4

质粒转染 当6孔板中培养细胞覆盖率满意时，以质粒悬液：缓冲液：jetPRIME®试剂=1∶100∶2的比例配制转染混合物，并孵育10～15 min，将6孔板中的培养基清洗并更新，孵育结束后将转染混合物加入其中，置于37 ℃、5% CO的培养箱中，24 h后更换培养基，并继续放入培养箱中培养，留用于后续实验。

1.2.5

CCK-8实验 在细胞系转染后的24、48、72 h分别对6孔板中的各组细胞进行消化，并计数。将适当浓度的细胞悬液接种于96孔板中(100 μl/孔)，另有孔加入相应量不含细胞的培养基作为空白对照。待细胞贴壁后，将10 μl的CCK-8溶液加入到孔中，在培养箱内孵育4 h,经过酶标仪450 nm处测量吸光度的值，反复测量3次，取实验结果的平均值作为最终结果。

2 结果

2.1 免疫组化实验检测ASH2L在细胞中的表达定位

在上皮性卵巢癌组织中，ASH2L的表达定位于细胞核中(图1)。

图1 卵巢组织免疫组化染色

2.2 Western blot实验检测组织中ASH2L蛋白的表达

提取组织的总蛋白，Western blot方法检测上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织中ASH2L蛋白的表达量，结果显示：上皮性卵巢癌组织的ASH2L蛋白表达水平高于正常卵巢组织(图2)，两组间比较差异有统计学意义(

P

<0.01)。

图2 Western blot法检测各组组织中蛋白表达情况

2.3 Western blot实验检测细胞系中ASH2L蛋白的表达

分别培养人卵巢癌细胞系SKOV-3及人肾上皮细胞系293T，提取两种细胞系的总蛋白，Western blot方法检测SKOV-3和293T细胞系中ASH2L蛋白的表达量，结果显示：SKOV-3细胞系中ASH2L蛋白的表达水平高于293T细胞(图3)，两组间比较差异有统计学意义(

P

<0.05)。

图3 Western blot法检测细胞系中蛋白表达情况

2.4 CCK-8实验检测转染质粒后细胞系的增殖情况

对SKOV-3细胞分别进行ASH2L质粒转染和空载质粒转染，采用Western blot方法检测转染后ASH2L蛋白的表达量，验证SKOV-3细胞中的转染效率。结果显示，与转染空载质粒的SKOV-3细胞相比，转染ASH2L质粒的SKOV-3细胞中ASH2L蛋白明显高表达，差异有统计学意义(

P

<0.01，图4)。在SKOV-3成功转染后的24、48、72 h，转染空载质粒和转染ASH2L质粒的SKOV-3细胞对比研究，采用CCK-8实验验证，结果显示转染后24、48和72 h，ASH2L转染组较空载转染组的细胞增殖能力均有所增加，且两组间的细胞增殖差异随时间的延长逐渐增加(图5)，组间差异有统计学意义(

P

<0.01)。

图4 Western blot实验检测转染后细胞蛋白表达情况

图5 CCK-8检测细胞系增殖情况

3 讨论

研究指出：血清中游离甲基化DNA的表达水平可以反映肿瘤组织的增生状态，可作为肿瘤早期诊断的标志物之一，而多重巢式特异性甲基化PCR检测可作为潜在的上皮性卵巢癌早期诊断的方法之一。

DNA的不同修饰可以使染色体的结构和功能发生改变，进而导致基因表达以及细胞行为的改变。在人类肿瘤基因图谱的研究中：哺乳动物蛋白H3K4甲基转移酶即MLL复合物的家族特异性基因异常与多种恶性肿瘤的发生发展、转移相关。MLL酶以腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移至组蛋白H3K4e-氨基上，完成H3K4的甲基化修饰，可分为MLL和SETI A/B两类甲基化酶。MLL复合物的核心蛋白包括WDR5、RbBP5、ASH2L及DPY30。相关研究发现：敲除MLL复合物中的ASH2L核心蛋白，可导致MLL复合物酶活性的降低。

有文献表明，肿瘤细胞增殖过程中有ASH2L的参与：癌蛋白MYC可与ASH2L发生相互作用；乳腺癌、胰腺癌、喉癌肝癌、宫颈癌、结肠癌及皮肤黑色素瘤等肿瘤中均存在ASH2L的高表达；Qi et al的研究表明，乳腺癌标本及相关癌细胞系内，存在ASH2L的高表达，且ASH2L的表达水平与ERα相关；Cheng et al研究显示，肺癌的恶性程度受MMP9和ASH2L的表达水平调控，抑制ASH2L的表达可以有效促进MMP9介导的肿瘤细胞的浸润和迁移。ASH2L蛋白表达通过表观遗传学机制间接地影响着恶性肿瘤的发生发展，该研究表明ASH2L在上皮性卵巢癌中表达升高，高表达的ASH2L可促进卵巢上皮性肿瘤细胞SKOV-3的增殖，这表明ASH2L与卵巢癌同样有着密切的联系，参与它的发生发展，而其中的具体机制还需要将来更多的思考和实验来探索。