CLIC4对胃癌细胞SGC-7901增殖与迁移的影响

李 瑶，冯 成，程晓敏，李 超，耿慧武，刘晓颖，王 华

中国是胃癌发病率和病死率较高的国家之一，亟需更有效的生物标志物或药物靶标。CLIC4作为胞内氯离子通道(chloride intracellular channel, CLICs)蛋白家族成员之一，在某些肿瘤类型和基质细胞中异常高表达，且其定位和功能的改变，在肿瘤发生发展中发挥重要作用。有研究表明，子宫平滑肌瘤、神经胶质瘤和黑色素瘤等肿瘤形成过程中CLIC4的表达显著上调；而人原发性肺癌和肺癌细胞系中CLIC4的表达减少，表明其抑制肺癌细胞生长；siRNA介导的CLIC4下调促进小鼠肝癌Hca-F和Hca-P细胞的凋亡。目前CLIC4对胃癌作用的研究鲜有报道，该研究从胃癌细胞系SGC-7901着手，研究CLIC4对细胞增殖与迁移的影响，为进一步探索CLIC4在胃癌恶性进展中的作用提供重要线索。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1

主要试剂 胎牛血清购于以色列Biological Industries公司；RPMI-1640和Opti-MEM培养基购于美国GE公司；胰酶细胞消化液、青霉素-链霉素混合液、Western细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Western一抗稀释液购于上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine RNAi MAX试剂购于美国Thermo-Fisher公司；PVDF膜购于加拿大Bio Basic公司；β-actin、CLIC4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin抗体购于武汉Proteintech公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG、DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.2

主要仪器 CO恒温培养箱(VIOS 160i，美国 Thermo-Fischer公司)；BSC-2级生物安全柜(1300，美国Thermo-Fischer公司)；倒置光学显微镜(TS-100，日本株式会社尼康)；高速冷冻离心机(Microfuge 20R，美国Beckman Coulter公司)；恒压电泳仪(PowerPacBasic，美国BIO-RAD公司)。

1.1.3

shRNA和siRNA CLIC4 shRNA、siRNA和阴性对照shRNA、siRNA合成于上海吉玛生物科技有限公司，序列为见表1、2。

表1 shRNA序列

表2 siRNA序列

1.1.4

质粒、细胞株 慢病毒包装所用pLKO.1、REV、GAG、VSVG质粒由中国科学技术大学吴缅教授课题组惠赠；HEK 293T、GES-1、 SGC-7901、BGC-823、MGC-803、MKN-45、N87、AEG-1细胞为本实验室保存；其中GES-1，为正常腺上皮细胞，作为对照组，SGC-7901、BGC-823、MGC-803、MKN-45、N87、AEG-1均为胃癌细胞系。

1.2 实验方法

1.2.1

细胞培养和传代 HEK 293T细胞系使用DMEM高糖培养基；GES-1、SGC-7901、BGC-823、MGC-803、MKN-45、N87和AEG-1细胞系使用RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5 % CO、95 %湿度的培养箱中分别培养，细胞培养所用器具均经高压蒸汽灭菌；培养的细胞每1～2 d换液1次，显微镜下观察细胞密度和细胞状态，当细胞密度大于90 %时可进行传代，使用胰酶对目的细胞进行消化，以培养基终止消化反应并计数，接种适量细胞悬液到培养瓶中，于37 ℃恒温培养箱中继续培养。

1.2.2

慢病毒包装 以1.5×10个/孔的数量接种HEK 293T细胞于6孔板；次日观察细胞贴壁生长至70%～80%后，使用Lipofectamine2000将混合质粒转染至细胞中；转染时质粒所用的比例为pLKO.1(或含相应shRNA的质粒)：GAG∶REV∶VSVG(后3者在细胞内共同形成慢病毒)=2∶2∶2∶1；在转染6～8 h后更换新鲜的无抗生素培养基；在转染30 h后收集培养液上清液中的病毒以进行后续实验。

1.2.3

shRNA敲低实验 感染前1 d，将SGC-7901细胞以2.0×10个/孔接种于6孔板，次日观察贴壁后，加入上述包装得到的病毒悬液和适当的polybrene(终浓度：6～8 μg/ml)以感染SGC-7901；在6 h后换新鲜培养基；在48 h后使用嘌呤霉素筛选阳性细胞，并收集细胞进行验证。

1.2.4

siRNA敲低实验 转染前1 d，将待转染细胞以1.5×10个/孔的数量接种于6孔板；次日观察贴壁后，使用Lipofectamine RNAi MAX转染siRNA；转染6 h后更换新鲜培养液。

1.2.5

细胞总蛋白提取 收集细胞沉淀，加入适当体积的细胞裂解液，冰上裂解30 min左右，每5 min涡旋1次；4 ℃，14 000 r/min离心25 min，将上清液转移至新的EP管中，Bradford法测蛋白浓度。

1.2.6

Western blot实验 各取30 μg总蛋白样品，于金属浴上100 ℃加热8～10 min变性，SDS-PAGE电泳分离目的蛋白，转移蛋白于PVDF膜；5 %脱脂牛奶于室温封闭1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min；一抗孵育4 ℃过夜，TBST洗膜3次；室温孵育二抗1.5 h，TBST洗膜3次；ECL显影。使用Image J软件进行条带的吸光度分析，并以β-actin为内参计算CLIC4的相对表达水平。

2 结果

2.1 CLIC4在胃癌细胞系中的表达

Western blot检测胃癌细胞系中CLIC4的表达情况。结果显示，与对照组(GES-1)相比，胃癌细胞系中CLIC4均高表达。对条带的灰度值进行测定，以β-actin作为内参，进行半定量分析，对3次重复实验的结果进行汇总，同时以GES-1组的数据为基准，制作胃癌细胞系中CLIC4蛋白相对含量的直方图(见图1)。与对照组相比，胃癌细胞系中CLIC4高表达，且差异有统计学意义，见表3。

图1 Western blot检测胃癌细胞系中CLIC4的表达

表3 各组中CLIC4的统计结果

2.2 CLIC4敲低对SGC-7901的细胞增殖的影响

为了进一步研究CLIC4在胃癌发生发展过程中发挥的生物学作用，使用CLIC4 shRNA慢病毒感染胃癌细胞SGC-7901，并通过嘌呤霉素筛选及Western blot验证目的蛋白的表达，构建CLIC4敲低的稳转细胞株，同时使用空白慢病毒载体pLKO.1(NC)做阴性对照。结果如图2所示，与NC相比，各shRNA组的CLIC4表达量均降低，选择1、2和3序列进行后续研究；经三代验证，SGC-7901稳定低表达CLIC4的细胞株构建成功(图2)。为避免嘌呤霉素药筛对细胞凋亡检测的影响，同时使用CLIC4 siRNA转染SGC-7901，转染72 h后收集细胞沉淀，进行Western blot验证。结果显示，与NC相比，CLIC4的两条siRNA序列均有敲低效果。在确认了siRNA及shRNA对CLIC4的敲低效果后，利用克隆形成实验以及CCK-8实验检测CLIC4敲低对胃癌细胞SGC-7901增殖的影响，结果见图3。克隆形成实验结果表明，与NC组相比，SGC-7901 细胞中CLIC4 sh1、2和3三条敲低序列的克隆数差异无统计学意义，且CCK-8结果进一步验证，CLIC4敲低对胃癌细胞的增殖没有影响。

图2 Western blot检测SGC-7901细胞中CLIC4敲低效果

图3 CLIC4敲低后SGC-7901细胞的增殖情况

2.3 CLIC4敲低对SGC-7901细胞的上皮-间质转化EMT(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响

为了探究CLIC4敲低对胃癌细胞迁移的影响，利用Western blot检测EMT相关蛋白的表达。结果显示，与NC相比，在SGC-7901细胞CLIC4 shRNA的1和2序列组中，E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达水平增加，β-连环蛋白(β-catenin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达无明显变化，波形蛋白(Vimentin)表达减少(图4)。该结果表明CLIC4敲低后，细胞上皮表型增强，间质表型减弱，说明细胞发生了EMT，相应的EMT过程受到抑制，结果见表4、5。

图4 Western blot检测SGC-7901细胞中CLIC4

表4 各组中N-cadherin的统计结果

表5 各组中vimentin的统计结果

3 讨论

CLICs家族成员具有不同功能，可参与调节肿瘤细胞的增殖、迁移及其对非肿瘤组织的侵袭。特别是CLIC4，可以靶向肿瘤细胞而不影响正常细胞的生理功能，具有成为肿瘤治疗新靶点的潜能。

CLIC4在细胞中定位于细胞膜、线粒体内膜，高尔基体和内质网。在特定组织中表达水平高，在一些肿瘤中过表达。细胞质中的CLIC4响应p53、DNA损伤和代谢应激而入核，使细胞生长停滞或凋亡。CLIC4表达水平和核易位在细胞应激/凋亡信号转导中起重要作用。还有研究表明，肿瘤中的CLIC4的细胞定位可能发生改变。

有研究表明，CLIC4参与调节多种肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭。结直肠癌肿瘤干细胞中高表达CLIC4，特别是转移能力强的肿瘤转移干细胞(metastatic cancer stem cell, MCSC)与转移能力弱的结肠癌细胞相比，CLIC4的表达水平更高，提示CLIC4参与调节结直肠癌MCSC的分化及其侵袭、转移行为。CLIC1和CLIC4沉默时，可以抑制默克尔细胞多瘤病毒小肿瘤抗原(MCPyVST)诱导的运动性和侵袭性，抑制默克尔细胞癌的进展。Suh et al利用CLIC4反义mRNA抑制CLIC4的表达，结果发现CLIC4下调促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，在体外和体内抑制人骨肉瘤细胞的生长。且CLIC4调节肿瘤间质成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，并且与肿瘤的进展有关，提示CLIC4还通过调节肿瘤微环境促进肿瘤的侵袭和转移。

本研究通过构建CLIC4稳定低表达胃癌细胞株，探究CLIC4在胃癌中的生物学功能。结果表明，CLIC4在胃癌细胞系中均高表达，不影响胃癌细胞SGC-7901的增殖。EMT是促进肿瘤侵袭、迁移的主要机制之一，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等是EMT的重要标志物，当E-cadherin的表达下降，N-cadherin和Vimentin表达增高时，肿瘤细胞骨架系统排列发生变化，细胞生物学性状改变，黏附功能下降，脱离原发灶，向周围组织侵袭和迁移。CLIC4敲低后E-cadherin的蛋白表达水平增加，Vimentin蛋白表达减少，从而抑制SGC-7901细胞的迁移，但具体分子机制仍需进一步探讨。

但也有研究表明，不同细胞类型CLIC4对其增殖的作用及机制也不同，如小鼠和人皮肤鳞状细胞癌中，过表达CLIC4抑制肿瘤生长并且促进TGF-β信号传导。在肺癌细胞中，敲除CLIC4促进细胞增殖与克隆形成能力。且CLIC4可能对同一肿瘤类型的不同分化程度也具有不同的作用。Wang et al的研究结果显示，在高分化胃癌细胞系NCI-N87中敲除CLIC4后，促进了EMT进而促进细胞迁移，细胞在裸鼠中成瘤能力增强；在低分化细胞系MKN-45中过表达CLIC4后，EMT被抑制，细胞干性表型减弱，细胞增殖被抑制。而本研究结果显示，在中分化的胃癌细胞系SGC-7901中敲低CLIC4后，细胞增殖无显著性变化，EMT被抑制，细胞迁移减弱。由此可以推测，在癌症的不同进程阶段，CLIC4可能发挥着不同的作用，也需要进一步的临床样本进行分析和验证。

综上所述，在胃癌细胞SGC-7901中，CLIC4通过促进胃癌细胞的迁移发挥促癌作用，但不影响其增殖。该研究为进一步探索CLIC4在胃癌恶性进展中的作用提供了重要线索，CLIC4可能作为临床上治疗胃癌的潜在靶点。