烟酰胺对鼻咽癌CNE-1细胞增殖、凋亡与迁移作用机制研究

杨亚利，张声源，潘增烽，陈欢珠，姚前尹

鼻咽癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，具有高复发和高转移性，主要分布在中国华南地区、东南亚和北非等区域。由于早期鼻咽癌患者症状的非特异性，临床上预测鼻咽癌发展的准确性不高。故研究鼻咽癌发生发展的分子机制，寻找用于鼻咽癌早期诊断及预后评估的分子标志物和安全有效的治疗药物有重要的临床意义。烟酰胺，又称维生素PP，具有加强DNA修复并参与能量代谢及肿瘤预防与治疗的作用。口服大剂量烟酰胺可增强鼻咽癌的放疗疗效，但其是否通过影响鼻咽癌细胞生长来增强疗效的分子机制需进一步确认。该研究以人鼻咽癌细胞CNE-1为研究对象，探讨烟酰胺对人鼻咽癌CNE-1细胞增殖、凋亡、周期和迁移能力的影响及其相关作用机制，旨在为其临床应用提供更多理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂

人鼻咽癌CNE-1细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库。烟酰胺，纯度>99%，货号：YZ-1001 15-100 mg，品牌：中检所。RPMI-1640培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)；青-链霉素(北京索莱宝公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京全式金生物公司)；细胞周期检测试剂盒(南京凯基生物公司)；Transwell细胞培养板(货号：353097)和matrigel胶(货号：356234)(美国Becton,Dickinson and Company公司)；p53和MMP-9单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.2 主要仪器

IX70倒置显微镜(日本Olympus公司)；Tecan Infinite 200全自动酶标仪(瑞士TECAN公司)；流式细胞仪(美国Becton,Dickinson and Company公司)；电泳仪、转膜电泳槽( 美国BIO-RAD公司)。

1.3 人鼻咽癌细胞CNE-1细胞培养

人鼻咽癌细胞CNE-1用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基置于37 ℃、5% CO的细胞培养箱中培养，隔天换培养液。待细胞长成致密单层后，以0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的人鼻咽癌CNE-1细胞用于后续实验。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖抑制率

取对数生长期的人鼻咽癌CNE-1细胞，调整细胞浓度为1×10个/ml，加入96孔板中，每孔100 μl。待细胞贴壁后弃去培养液，分为对照组和烟酰胺处理组，烟酰胺处理组加入烟酰胺至终浓度为10、20、40、80 μmol/L，对照组则加入等体积不含药物的完全培养基。培养48 h和72 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μl，培养2 h后，450 nm测定各孔的吸光度(optical density，OD)值，计算细胞增殖抑制率，抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%，实验重复3次，取平均值。

1.5 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞周期及凋亡

收集对照组细胞和40 μmol/L 烟酰胺处理48 h后的CNE-1细胞，调整细胞密度后用预冷的PBS洗涤3次，于295 μl细胞悬液中加入5 μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min，再加入碘化丙啶(PI)5 μl，4 ℃避光反应5 min，用流式细胞分析仪检测细胞周期及细胞凋亡率，并计算处于G/G期、S期和G/M期的细胞所占比例。

1.6 Transwell法检测细胞的迁移和侵袭

收集对照组和40 μmol/L烟酰胺处理48 h后的CNE-1细胞，调整细胞密度后加入Transwell小室。下室加入600 μl完全培养基。上室加入相应体积无血清的细胞悬液，培养48 h。取出小室，用4%多聚甲醛室温固定15 min，结晶紫染色10 min，PBS清洗1次，显微镜下观察。每个样本随机取5个视野计数透膜细胞并拍照，每个视野细胞计数3次，求出平均值。

1.7 qRT-PCR检测CNE-1细胞p53和MMP-9 mRNA水平

收集对照组和40 μmol/L烟酰胺处理48 h后的CNE-1细胞，提取细胞总mRNA，反转录成cDNA后进行qRT-PCR检测。引物序列有，MMP-9(F): 5′-GACGCCATCGCGGAGATTG-3′；MMP-9(R): 5′-GCCACTTGTCGGCGATAAG-3′；p53(F): 5′-CAAGACAGAAGGGCCTGACTC-3′；p53(R): 5′-CATCTCCCAAACATCCCTCAC-3′；Hsa-Actinβ(F): 5′-GGCACCCAGCACAATGAAG-3′；Hsa-Actinβ(R): 5′-GGTGTAACGCAACTAAGTCATAG-3′。

1.8 Western blot检测CNE-1细胞p53和MMP-9相关蛋白表达

收集对照组和40 μmol/L烟酰胺处理48 h后的CNE-1细胞，提取细胞总蛋白并进行蛋白定量检测，聚丙烯酰胺凝胶电泳及转膜，室温孵育一抗p53、MMP-9、β-actin(1∶1 000)，加相应辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)，最后经凝胶成像系统显影，凝胶分析软件处理计算各组 p53、MMP-9蛋白表达量。

2 结果

2.1 烟酰胺对人鼻咽癌CNE-1细胞增殖的影响

人鼻咽癌CNE-1细胞经不同浓度(10、20、40、80 μmol/L)烟酰胺处理作用48、72 h后，CNE-1细胞增殖受到不同程度的抑制，表现为随着OD值逐渐降低，增殖抑制率逐渐升高，各组CNE-1细胞增殖抑制率随着烟酰胺浓度的升高和处理时间的延长而升高，呈浓度和时间依赖。差异均有统计学意义(

P

<0. 01)，见图1。

图1 烟酰胺对鼻咽癌CNE-1细胞增殖抑制率的影响

2.2 烟酰胺对人鼻咽癌细胞CNE-1细胞凋亡和周期的影响

40 μmol/L烟酰胺处理CNE-1细胞48 h总凋亡率高于对照组(表1，图2A)，差异有统计学意义(

t

=2.78，

P

<0.01)；与对照组相比，40 μmol/L烟酰胺处理组G/G期细胞比例降低(

t

=4.30，

P

<0.01)，S期细胞比例无明显变化，G/M期细胞比例升高(

t

=2.78，

P

<0.05)(图2B)，表明烟酰胺能够将CNE-1细胞阻滞于G/M期。

2.3 烟酰胺对人鼻咽癌CNE-1细胞迁移和侵袭的影响

用40 μmol/L烟酰胺处理CNE-1细胞48 h后，与对照组相比，40 μmol/L烟酰胺处理组发生迁移的透膜细胞数减少(

t

=2.45，

P

<0.01)(图3A)；同时，相比于对照组，40 μmol/L烟酰胺处理组发生侵袭的透膜细胞数减少(

t

=2.45，

P

<0.01)(图3B)。

表1 烟酰胺对鼻咽癌CNE-1细胞凋亡和周期的影响

2.4 烟酰胺对人鼻咽癌CNE-1细胞中野生型p53和MMP-9表达的影响

与对照组相比，40 μmol/L烟酰胺处理组p53 mRNA相对表达量，p53基因表达量升高(

t

=2.30，

P

<0. 01)，同时p53蛋白表达量升高(图4A、C)；与对照组相比，40 μmol/L烟酰胺处理组基质金属蛋白酶MMP-9 mRNA相对表达量，MMP-9基因表达降低(

t

=2.78，

P

<0.01)，同时MMP-9蛋白表达量降低(图4B、D)。

图2 烟酰胺对人鼻咽癌CNE-1细胞凋亡和周期的影响

图3 烟酰胺对人鼻咽癌CNE-1细胞迁移和侵袭的影响×100

图4 烟酰胺对人鼻咽癌CNE-1细胞p53蛋白和蛋白酶MMP-9表达的影响

3 讨论

鼻咽癌是一种低分化、高转移性的恶性肿瘤，其发病与细胞周期失调密切相关。为了进一步了解鼻咽癌发生的分子机制，研究人员利用基因编辑技术，对鼻咽癌细胞进行全基因组CRISPR基因敲除筛选，鉴定并确认与NPC相关的细胞因子和信号通路，如MYST组蛋白乙酰化转移酶复合体、NF-κB信号通路及p53信号途径等。p53是细胞中最为重要的肿瘤抑制因子之一，它能够响应细胞内外众多的信号刺激，通过引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和促进DNA损伤修复等过程抑制肿瘤的发生发展。其在鼻咽癌及头颈部鳞癌、非小细胞癌、肺癌、膀胱癌等治疗中也有极其重要的地位。

该研究结果表明，人鼻咽癌CNE-1细胞经过烟酰胺处理后细胞增殖受到明显抑制，与浓度及时间具有一定相关性，且细胞凋亡增加。这与槲皮素通过非依赖性Caspase诱导NPC细胞凋亡的机制不同，本研究中肿瘤抑制基因p53的表达量显著升高，表明烟酰胺可能通过调节p53的表达去激活或抑制p53相关信号通路，从而诱导细胞的凋亡，并引发细胞周期阻滞。p53在肿瘤细胞中表达失调可加剧癌细胞的转移速率诱导，研究表明突变的p53可以通过Wnt信号通路参与调控中性粒细胞促进乳腺癌细胞的转移。在癌细胞迁移研究中，MMP-9在肿瘤侵袭、肿瘤诱导的血管生成、肿瘤微环境的免疫调节以及介导转移前微环境的形成以促进肿瘤细胞的远处转移等细胞扩散过程中发挥不同作用。同时已有研究显示MMP-1参与鼻咽癌细胞的侵袭过程。该研究中，烟酰胺可以明显抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭的能力，同时鼻咽癌细胞内MMP-9蛋白的表达显著降低。这与野生型p53表达上升，细胞凋亡进程恢复的结果一致，但烟酰胺抑制鼻咽癌的具体机制有待进一步研究。

综上，烟酰胺可通过上升p53蛋白的表达，恢复细胞周期抑制人鼻咽癌CNE-1细胞增殖，促进其凋亡，同时亦可影响MMP-9蛋白的表达降低CNE-1细胞迁移和侵袭能力。