miR101调控EZH2抑制胎盘滋养细胞葡萄糖吸收参与妊娠糖尿病机制研究

王圆圆，王明胜，赵玉洁，石中华

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指孕妇在妊娠期间发生或发现糖耐量减低，是产科常见的并发症。研究显示GDM给母婴带来极大的危害，高血糖可使胚胎发育异常或死亡，并且流产发生率极高，GDM孕妇妊娠期高血压疾病和后期糖尿病发生风险比非糖尿病孕妇高。目前GDM主要以降糖药物治疗为主，虽然具有一定疗效但安全性仍有很大的争议。近年来，多数学者热衷于从分子机制探讨GDM发病机制，如研究发现miR-29、miR-200a和miR-126等小分子物质在GDM患者与非GDM中表达水平存在差异，抑制miR-29b表达可上调缺氧诱导因子3A基因表达进一步促进胎盘滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭。微小RNA(microRNA)具有调控RNA转录水平功能的微小RNA，通过调节蛋白质编码基因的表达而作用于生物体内细胞，从而使目的基因mRNA翻译受到抑制或mRNA降解。miR101家族是高度保守的microRNA，可调节多种基因的表达，研究显示miR101过表达可下调组蛋白甲基转移酶同源序列2增强子(Enhancer of histone methyltransferase homologue 2 ，EZH2)和MYC基因表达从而能抑制乳腺癌细胞的增殖。EZH2可抑制染色质中的靶基因，与细胞生长调节有关。有学者认为胎盘滋养细胞的功能障碍可能与妊娠期高血压、GDM、胎儿生长受限、流产等妊娠并发症密切相关，胎盘滋养细胞对葡萄吸收与妊娠糖尿病具有一定关联。本研究旨在观察miRNA101影响EZH2表达水平及胎盘滋养细胞葡萄糖吸收情况，探讨miRNA101在妊娠期糖尿病中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取2018年1月—2018年5月在遵义医学院附属医院就诊的GDM孕妇30例和正常孕妇30例分别作为观察组和对照组，孕妇在妊娠24～28周进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，符合以下1项或以上的诊断标准即可诊断为GDM：空腹≥5.1 mmol/ L；1 h血糖≥10.0 mmol/L；2 h血糖≥8.5 mmol/ L。观察组和对照组在年龄、胎次等资料上具有可比性，差异无统计学意义，两组孕妇均为单胎，既往均无高血压、糖尿病、肾病及心血管疾病病史。所有患者均需签订知情同意书，并表示愿意积极配合研究工作，本次研究经过医院伦理委员会批准同意，符合伦理要求。

1.2 方法

1.2.1

样本收集 在孕妇分娩后立即剪取胎盘母体面小叶处组织，分为4份并用PBS洗涤液洗净，置于-80 ℃冰箱储存备用，用10%甲醛固定。

1.2.2

qRT-PCR检测胎盘组织miR101和EZH2 mRNA表达 严格按照各试剂盒和仪器说明书进行实验操作，利用qRT-PCR检测胎盘组织中miR101和EZH2 mRNA表达水平。

1.2.3

Western blot检测胎盘组织中EZH2蛋白表达 将各组细胞加入裂解缓冲液30 min，用离心机离心10 min，4 ℃、12 000 r/min，提取各组细胞的总蛋白。按照说明书方法，利用Western blot检测胎盘组织中EZH2蛋白表达水平。

1.3 细胞实验

1.3.1

细胞培养 取人绒毛膜滋养层细胞培养于含10%胎牛血清、双抗青霉素/链霉素液、高糖培养基中培养，置于37 ℃、5%CO的培养箱培养。

1.3.2

细胞转染 取miR101 mimics、miR101 mimics NC系列、miR101 inhibitor及miR101 inhibitor NC系列对上述培养的人绒毛膜滋养层细胞进行转染，将培养细胞置于按3×10个/孔接种于6孔板中，严格按照Lipofectamine2000说明书操作，加入1.5 μl miR101 mimics(M组)、miR101 mimics NC(M-NC组)、miR101 inhibitor(I组)及miR101 inhibitor NC(I-NC组)进行细胞转染，同时设立空白对照组(B组)，48 h后收集转染细胞进行后续实验。

1.3.3

qRT-PCR检测转染细胞miR101和EZH2 mRNA表达 严格按照各试剂盒和仪器说明书进行实验操作，利用qRT-PCR检测转染细胞miR101和EZH2 mRNA表达水平。

1.3.4

Western blot检测转染细胞EZH2蛋白表达 提取各组细胞的总蛋白，按照说明书方法，利用Western blot检测转染细胞EZH2蛋白表达水平。

1.3.5

转染细胞葡萄糖消耗量检测 取各组细胞接种于96孔培养板中，培养24 h后，取各组细胞的培养上清液，用葡萄糖测定试剂盒检测细胞对葡萄糖的吸收量，计算各组转染细胞葡萄糖消耗量(葡萄糖消耗量=培养基葡萄糖含量-24 h后所测葡萄糖含量)。

2 结果

2.1 胎盘组织miR101表达

qRT-PCR结果显示，观察组胎盘组织miR101表达水平高于对照组(

t

=5.433,

P

<0.05)(图1)。

图1 2组miR101表达水平比较与对照组比较：*P<0.05

2.2 胎盘组织EZH2表达

qRT-PCR结果显示，观察组胎盘组织EZH2mRNA表达水平低于对照组(

t

=2.352,

P

<0.05)(图2A)，Western blot检测结果显示，观察组胎盘组织EZH2 蛋白表达水平低于对照组(

t

=2.178,

P

<0.05)(图2B、图3)。

图2 2组EZH2表达表达水平比较

图3 Western blot检测胎盘组织EZH2蛋白表达

2.3 细胞转染后miR101表达

qRT-PCR结果显示(图4)，miR101表达水平在B组、M-NC组和M组差异有统计学意义(

F

=27.302，

P

<0.05)，M组高于B组(

t

=2.133，

P

<0.05)，M组高于M-NC组(

t

=2.167，

P

<0.05)。miR101表达水平在B组、I-NC组和I组差异有统计学意义(

F

=16.499，

P

<0.05)，I组低于B组(

t

=2.918，

P

<0.05)，I组低于I-NC组(

t

=2.331，

P

<0.05)。

2.4 细胞转染后EZH2表达

qRT-PCR结果显示(图5A、B)，EZH2 mRNA表达水平在B组、M-NC组和M组差异有统计学意义(

F

=15.381，

P

<0.05)，B组高于M组(

t

=3.266，

P

<0.05)，M-NC组高于M组(

t

=3.190,

P

<0.05)；EZH2 mRNA表达水平在B组、I-NC组和I组差异有统计学意义(

F

=9.463，

P

<0.05)，B组低于I组(

t

=2.276，

P

<0.05)，I-NC组低于I组(

t

=2.176,

P

<0.05)。Western blot检测结果显示(图5C、D，图6)，EZH2蛋白表达水平在B组、M-NC组和M组差异有统计学意义(

F

=17.593，

P

<0.05)，B组高于M组(

t

=2.018，

P

<0.05)，M-NC组高于M组(

t

=2.257,

P

<0.05)；EZH2蛋白表达水平在B组、M-NC组和M组差异有统计学意义(

F

=21.748，

P

<0.05)，B组低于I组(

t

=3.271，

P

<0.05)，I-NC组低于I组(

t

=3.167，

P

<0.05)。

图4 细胞转染后miR101表达水平

图5 细胞转染后EZH2表达水平

图6 Western blot检测各组转染细胞EZH2蛋白表达

2.5 细胞转染后葡萄糖吸收情况

B组(1.26±0.20) mmol/L、M-NC组(1.22±0.12) mmol/L和M组(1.75±0.21) mmol/L葡萄糖消耗量差异有统计学意义(

F

=12.523，

P

<0.05)，M组高于B组和M-NC组(

t

=3.106、2.115，均

P

<0.05)。B组、I-NC组(1.13±0.27) mmol/L和I组(0.68±0.09) mmol/L葡萄糖消耗量差异有统计学意义(

F

=31.161，

P

<0.05)I组低于B组和I-NC组(

t

=2.002、2.158，

P

<0.05)。

3 讨论

GDM的病因极为复杂，迄今为止仍未得以完全阐明。研究表明遗传基因、炎症因子、脂肪细胞因子和胰岛素抵抗是其主要病因，尤其是胰岛素抵抗患者在GDM的发病中有着重大作用。胰岛素抵抗的产生主要原因是靶组织对胰岛素的敏感性降低，持续性的胰岛素抵抗会造成胰岛β细胞的胰岛素分泌绝对或相对不足，进而引起糖尿病的发生。

miRNAs是调控靶向基因的小分子非编码RNA，在细胞增殖、分化和代谢中扮演了重要的角色，多项研究表明miRNAs参与多种疾病病理机制。目前，在miRNAs与GDM关联研究中，多数学者的观点都支持GDM发病与miRNAs调控靶向基因相关，尽管发病相关机制不是很明确，但通过体外实验和模拟实验可证实它们存在一定联系。miR101作为microRNA的一种，学者对其研究比较深入，以往研究中miR101被认为是促癌基因，miR101过表达会促进卵巢癌细胞和肺癌细胞的增殖。安丽 等在总结miR101与糖脂代谢关联研究中，提到miR101与2型糖尿病和GDM发生息息相关。EZH2是由组蛋白、赖氨酸、N-甲基转移酶组成的核心蛋白复合体，与细胞生长调节有关。有多项研究证实，miR101可通过调控EZH2表达参与调控多种疾病的进展。

本研究结果显示，GDM患者胎盘组织miR101表达水平更高，而EZH2表达水平下降，提示miR101过表达可能是GDM发病的潜在风险。为了进一步验证GDM与miR101的相关性，开展了体外细胞实验，给人绒毛膜滋养层细胞转染miR101 mimics和miR101 inhibitor试剂，通过上调和抑制miR101的表达观察EZH2表达和细胞对葡萄糖吸收量的影响。结果表明过表达的miR101能抑制EZH2表达，促进细胞吸收葡萄糖，抑制miR101表达呈现出相反的结果。因此推测，过表达的miR101可下调EZH2表达，EZH2表达水平下降使胎盘滋养层细胞发生胰岛素抵抗，从而导致葡萄糖吸收受到影响。

综上，miR101可能通过调控EZH2表达降低胎盘滋养细胞对葡萄糖吸收量，参与GDM病理机制。该研究仍有不足之处，研究人群样本量相对较少，不具有群体代表性，有些微小效应仍未观察到，进一步了解该分子机制仍需要构建动物模型进行验证。