Lnczc3h7a对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响及其机制

任鹏涛，郝英豪，阮红训，秦晓宁，张 苑，黄 炜

结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率较高，患者5年生存率较低。结直肠癌的发生发展受多种基因及蛋白的调控，研究相关分子的生物学作用对解析结直肠癌的发病机制意义重大。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可对多种疾病的生理、病理过程产生影响。Lnczc3h7a是近年来新发现的lncRNA家族成员，其参与某些肿瘤的发生和发展，但作用机制目前还鲜有报道。胶原三股螺旋重复蛋白6(collagen triple helix repeat protein 6，CTHRC6)是一种分泌性糖蛋白，具有促进细胞迁移和减少胶原沉积的功能。研究显示CTHRC6在结直肠癌、食管癌等实体瘤中异常表达，可能与肿瘤的侵袭、迁移有关。该研究拟分析Lnczc3h7a在结直肠癌细胞中的表达及其对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

6种结直肠癌细胞株(SW620、SW480、HCT116、DLD-1、Caco-2、HT-29)及正常结直肠上皮细胞系(FHC)均购自北京中国医学科学院基础医学研究所；鼠抗人CTHRC6抗体及GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司；Lnczc3h7a模拟物(Lnczc3h7a mimics)和Lnczc3h7a抑制物(Lnczc3h7a inhibitor)购自广州锐博生物有限公司；脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；RNA提取试剂盒、RT-PCR反转录试剂盒及荧光定量试剂盒购自日本Takara公司；荧光定量PCR仪7500购自美国ABI公司；酶标仪PerkinElmer购自美国Enspire公司。

1.2 方法

1.2.1

RT-PCR法检测Lnczc3h7a在结直肠癌细胞中的表达 按照RNA提取试剂盒说明书的操作步骤，提取6种结直肠癌细胞株和正常结直肠上皮细胞中的总RNA。按照RT-PCR反转录试剂盒说明书合成cDNA。按照荧光定量试剂盒说明书，使用ABI 7500 PCR仪进行RT-PCR反应。采用2方法计算Lnczc3h7a的表达水平，以GAPDH为内参。

1.2.2

细胞转染 取对数生长期的SW620细胞分别接种于3个T75培养瓶。待细胞融合率达70%～80%时，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书将Lnczc3h7a mimics和Lnczc3h7a inhibitor转染细胞分别作为Lnczc3h7a mimics组和Lnczc3h7a inhibitor组，将未转染细胞作为对照组。转染48 h后，收集细胞进行后续实验。

1.2.3

CCK-8法检测Lnczc3h7a对结直肠癌细胞增殖的影响 将如上Lnczc3h7a mimics组、Lnczc3h7a inhibitor组、对照组收集的细胞以5×10/L密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后，加入CCK-8溶液和含10%新生牛血清的1640完全培养基，于37℃、5% CO饱和湿度的培养箱中培养。分别于1、2、3、4、5 d时间点检测细胞的增殖能力，并绘制细胞生长曲线。

1.2.4

划痕实验检测Lnczc3h7a对结直肠癌细胞迁移能力的影响 将如上Lnczc3h7a mimics组、Lnczc3h7a inhibitor组、对照组收集的细胞以2×10个/L密度接种于6孔板中，置于CO培养箱进行培养。待细胞融合率达到90%以上，使用无菌枪头在细胞培养皿中进行划痕，经无菌PBS洗涤后，加入含0.5%新生牛血清的1640完全培养基，于37 ℃、5% CO饱和湿度的培养箱中培养，分别采集0、24、48 h时间点的细胞迁移图像，并计算迁移率。

1.2.5

Western blot检测CTHRC6蛋白的表达 收集3组细胞，经裂解后提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取各组蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，湿转至硝酸纤维素膜上，使用脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入按照CTHRC6抗体(1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜；次日，经TBS-T洗涤3次后，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)，室温摇床孵育2 h，经TBS-T洗涤3次后，使用化学发光底物试剂检测目的蛋白，曝光X线胶片，并利用Quantity One软件进行图像分析。

2 结果

2.1 Lnczc3h7a在结直肠癌细胞株中的表达情况

RT-PCR法检测结果显示6种结肠癌细胞株SW620、SW480、HCT116、DLD-1、Caco-2、HT-29中Lnczc3h7a的相对表达水平均低于正常结直肠上皮细胞FHC，差异均有统计学意义(

P

<0.05)，见图1。3组的Lnczc3h7a的相对表达水平比较见图2。

2.2 Lnczc3h7a对结直肠癌细胞增殖能力的影响

CCK-8检测结果显示：转染1～3 d后，3组之间细胞增殖能力差异无统计学意义(

P

>0.05)；转染4～5 d后，Lnczc3h7a mimics组细胞增殖能力低于Lnczc3h7a inhibitor组和对照组(

P

<0.05)，Lnczc3h7a inhibitor组细胞增殖能力高于对照组(

P

<0.05)，见图3。

图1 Lnczc3h7a在结直肠癌细胞株中的表达情况与FHC细胞比较：*P<0.05

图2 3组的Lnczc3h7a表达水平比较

2.3 Lnczc3h7a对结直肠癌细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，在培养24、48 h后，对照组的伤口愈合率分别为(72.10±6.12)%、(59.73±8.32)%，Lnczc3h7a mimics组的伤口愈合率分别为(82.29±5.03)%、(72.81±6.27)%，Lnczc3h7a inhibitor组的伤口愈合率分别为(59.42±5.73)%、(38.69±7.64)%，3组比较的差异均有统计学意义(

F

=395.524、480.165,

P

<0.05)；与对照组相比，Lnczc3h7a mimics组细胞迁移能力降低(

P

<0.05)，Lnczc3h7a inhibitor组细胞迁移能力升高(

P

<0.05)，见图4。

图3 Lnczc3h7a对结直肠癌细胞增殖能力的影响

2.4 Lnczc3h7a对结直肠癌细胞中CTHRC6蛋白表达的影响

生物信息学分析显示，Lnczc3h7a与CTHRC6蛋白具有相似的结合位点，二者可能存在内在调控关联，为了进一步验证Lnczc3h7a对CTHRC6蛋白表达的影响，该研究检测了Lnczc3h7a mimics组、Lnczc3h7a inhibitor组、对照组中CTHRC6蛋白的表达情况，Western blot 检测结果显示，与对照组相比，Lnczc3h7a inhibitor组中CTHRC6蛋白表达升高(

P

<0.05)，Lnczc3h7a mimics组中降低(

P

<0.05)，见表1、图5。

3 讨论

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，近年我国结直肠癌的发病率和病死率均呈增高趋势。目前所知，结直肠癌的发生发展是一个多因素参与的复杂生物学过程。探究结直肠癌发生发展过程中所涉及的关键分子的生物学作用，对于结直肠癌的临床治疗具有重要意义。

图4 划痕实验法检测Lnczc3h7a对结肠癌细胞迁移能力的影响

表1 3组各肿瘤细胞株中的CTHRC6蛋白表达水平

图5 Western blot法检测Lnczc3h7a对结直肠癌细胞中CTHRC6蛋白表达的影响1：对照组；2：Lnczc3h7a inhibitor组；3：Lnczc3h7a mimics组

lncRNA是一类长约220个核苷酸的非编码长链RNA，其可在表观遗传学、基因组转录水平及转录后水平等多个层面上调控基因的表达。Lnczc3h7a是近年发现的一种新的lncRNA，其在头颈部肿瘤、结直肠癌、胃癌、神经母细胞瘤、肾癌等多种肿瘤细胞中的表达存在很大的差异性。最近有研究表明，Lnczc3h7a在某些高侵袭能力的肿瘤细胞系中表达下调。另有研究显示Lnczc3h7a与结直肠癌患者病情的恶性程度有关，但其在结直肠癌中的作用尚不清楚。本研究首先分析了Lnczc3h7a在结肠直癌细胞株和正常结直肠上皮细胞中表达的差异性，结果显示6种结肠癌细胞株SW620、SW480、HCT116、DLD-1、Caco-2、HT-29中Lnczc3h7a的相对表达水平均低于正常结直肠上皮细胞株FHC(

P

<0.05)，这一结果表明Lnczc3h7a可能参与了结直肠癌的发生发展过程。由于Lnczc3h7a在SW620细胞中表达最低，因此本研究中选取SW620细胞株作为后续实验细胞株。为了进一步研究Lnczc3h7a在结直肠癌中的作用，本研究通过向SW620细胞分别转染Lnczc3h7a mimics和Lnczc3h7a inhibitor，实现调控Lnczc3h7a的表达水平，结果显示，与对照组相比，Lnczc3h7a mimics组细胞增殖能力和迁移能力降低(

P

<0.05)，Lnczc3h7a inhibitor组细胞增殖能力和迁移能力升高(

P

<0.05)，表明Lnczc3h7a可能是通过抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移而发挥抑癌基因的作用。该研究通过生物信息学软件预测了Lnczc3h7a的靶基因，结果显示Lnczc3h7a与CTHRC6具有相似的结合位点，二者可能存在内在调控关联。CTHRC6蛋白是一种分泌性糖蛋白，具有促进细胞迁移和减少胶原沉积的功能。最近有研究表明，CTHRC6在结直肠癌细胞中高表达，靶向沉默CTHRC6表达可降低结直肠癌细胞的增殖能力。为了验证Lnczc3h7a对结直肠癌细胞中CTHRC6蛋白表达的影响，该研究检测了Lnczc3h7a mimics组、Lnczc3h7a inhibitor组、对照组中CTHRC6蛋白的表达情况，结果显示，与对照组相比，Lnczc3h7a inhibitor组中CTHRC6蛋白表达升高(

P

<0.05)，Lnczc3h7a mimics组中CTHRC6蛋白表达降低(

P

<0.05)，这一结果表明，Lnczc3h7a对结直肠癌CTHRC6蛋白表达具有抑制作用。因此推测Lnczc3h7a可能是通过靶向作用于CTHRC6抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移能力。

Lnczc3h7a在结肠直肠癌细胞株中表达下调，Lnczc3h7a过表达可抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移能力，Lnczc3h7a可能通过靶向作用于CTHRC6而抑制结直肠癌细胞增殖和迁移。