亚抑菌浓度抗生素对高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因表达的影响

宋国滨，王 刚，黄 颖，吴文娟，徐元宏

高毒力肺炎克雷伯菌(

hypervirulent

Klebsiella

pneumoniae

,

hvKP

)及其相关的研究受到国内外广泛关注。但是目前，临床医生在治疗该菌引起的感染时，由于不合理应用抗生素，进入患者体内的抗生素浓度受到许多因素影响，比如指征使用是否合理、品种选择是否合理、时机使用是否合理，另外还与用药剂量、用药部位、用药方式以及患者自身消化吸收能力密切相关。因此，在这些因素的影响下导致进入患者体内的浓度不足以杀灭病原菌，而且亚抑菌浓度抗生素会显著影响菌株的病原学行为，这种影响也会随着抗生素的不同而有所变化。有研究表明，氧氟沙星、红霉素在亚抑菌浓度对空肠弯曲菌的作用下，不仅不能抑制病原菌繁殖，反而可以使繁殖更加活跃，合成释放毒素更加明显。该研究对

hvKP

在亚抑菌浓度抗生素作用下，研究2种毒力基因——

rmpA

、

aerobactin

的表达水平，为临床合理应用抗生素、更好地治疗患者提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2018年1月—12月的

hvKP

共57株。剔除同一患者相同部分的重复菌株。大肠埃希菌ATCC8739为质谱鉴定实验质控菌株，肺炎克雷伯菌(

Klebsiella

pneumoniae

,

KP

)质控细菌为ATCC700603,为本实验室保存。

1.2 实验仪器及试剂

高速冷冻离心机(上海力新仪器有限公司)；GeneAmp970基因扩增仪(美国PE公司)；C-880V CO孵箱、紫外线凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；VITEK MS质谱仪(法国梅里埃公司)；抗菌药物(英国OXOID公司)；琼脂糖、引物(上海生工生物股份有限公司)；标志物DNA Marker、Premix TaqTM(日本TaKaRa公司)；VITEK MS CHCA基质液(法国梅里埃公司)；哥伦比亚血平板(合肥天达诊断试剂有限公司)；Muller-Hinton琼脂(江门市凯林贸易有限公司)。

1.3 菌株鉴定及药敏分析

菌种分离划线于血平板，长出菌落后，用MALDI-TOF MS质谱仪重新鉴定，采用纸片扩散(K-B)法及Vitek-2 compact仪器进行药敏实验,微量肉汤稀释法测定菌株对头孢西丁和阿米卡星的MIC值，判读及结果解释根据2018年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)文件进行。

1.4 荚膜血清型及相关毒力基因检测

通过煮沸法提取细菌基因组作为DNA模板，分别扩增6种荚膜血清型基因及8种相关毒力基因。将

aerobactin

基因阳性的菌株定义为

hvKP

。基因类型及引物序列参考文献，于表1中列出，反应体系为25 μl，95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，50～58 ℃退火90 s，72 ℃延伸1 min，进行35个循环，72 ℃延伸10 min，最后于4 ℃保存。

表1 各种引物(荚膜血清型及相关毒力基因)序列

1.5 亚抑菌浓度抗生素作用下毒力相关基因表达水平检测

挑取每株菌的单个菌落经麦氏比浊仪调0.5麦氏浊度后，用MH肉汤培养基稀释10倍，分装到4个EP管中，根据每株菌对2种药的MIC值，计算抗生素用量，使3个EP管中抗生素终浓度分别达到1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，第1管不加抗生素作为对照。于37 ℃温箱中摇菌6 h后，进行提mRNA、逆转录及qRT-PCR，以16SRNA作为内参基因，设计适用于qRT-PCR 2对毒力基因的引物，见表2。

表2 qRT-PCR毒力基因的引物

1.6 ERIC-PCR同源性分析

引物序列：ERIC1，ATGTAAGCTCCTGGGGATTCA；ERIC2，AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。扩增条件如下：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共20个循环，随后94 ℃变性1 min，42 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，进行35个循环，72 ℃延伸5 min。取扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳(100 V、100 min，0.5×TAE)，根据参考文献的标准进行分析。

1.7 MALDI-TOF MS同源性分析

用无菌接种环直接将新鲜细菌涂布于靶板上，取1 μl CHCA基质液均匀覆盖其表面，待自然晾干后上机检测，通过对不同位置100次的激光点击而获得每一个样品的蛋白质谱峰，仪器可检测的蛋白质质量范围为2 000～20 000 Da，得到的蛋白质谱峰信息经软件校正，然后与仪器内的微生物数据库图谱进行比对，从而得到鉴定结果。通过VITEK MS SARAMIS软件查看分析鉴定结果，并导入图谱数据库进行聚类分析，相似度<70%者为不同的质谱型别，用Ⅰ～Ⅲ表示不同的型别。

2 结果

2.1 药物敏感性

57株

hvKP

除对氨苄西林天然耐药外，对大部分临床常用抗生素都维持在较高的敏感率，其对各类抗生素耐药率情况见图1。

图1 57株高毒力肺炎克雷伯菌的耐药率

2.2 荚膜血清型和毒力基因检出情况

通过PCR技术检出K1型、K2型、K20型、K57型分别为17株、21株、2株、8株，检出率分别为29.8%、36.8%、3.5%、14%。有9株未检出荚膜血清型，未检出K5型、K54型荚膜血清型。检出毒力基因

rmpA

、

aerobactin

、

alls

、

kfu

、

wcag

、

magA

、

fimH

、

mrkD

分别为57株、57株、8株、21株、17株、16株、57株、57株。阳性标本条带图见图2。

图2 荚膜血清型和毒力基因阳性条带图

2.3 亚抑菌浓度抗生素下毒力基因表达情况

根据数据统计表明，与对照组相比，在头孢西丁的作用下

rmpA

及

aerobactin

的表达量都受到明显的抑制，其差异有统计学意义(

F

=14.33,

P

<0.05)；在阿米卡星作用下，与对照组相比，

rmpA

及

aerobactin

的表达同样受到了抑制，其差异有统计学意义(

F

=12.47，

P

<0.05)。见图3。

2.4 ERIC-PCR及MALDI-TOF MS同源性分析

ERIC-PCR将57株菌株分为19个型别，其中A、B、C型各4株，D—I型各3株，J—L型各2株，M、N型各6株、5株，O—S型菌株各1株。MALDI-TOF MS按照蛋白图谱相似性≥70%标准将57株菌株分为3型，用Ⅰ—Ⅲ来表示，见图4。

3 讨论

KP

属于肠杆菌科细菌家族之一，可以引起社区和医院获得性感染，已经成为除大肠埃希菌外，分离率最多的条件致病菌，可使免疫力低下的患者发生尿路感染、腹腔感染、血流感染、肺部感染等，尤其是

hvKP

，由于细胞壁外有一层厚厚的荚膜，可以抵抗中性粒细胞的杀伤作用，可以引起正常青年人肝脓肿并易向远处转移，多见合并眼内炎、神经系统炎症等，已引起广泛关注，有研究表明，与经典型肺炎克雷伯菌(

classic

klebsiella

pneumoniae

，

cKP

)相比，

hvKP

只需要50个细菌就可引起小鼠的死亡，而

cKP

则需要10个细菌才可引起小鼠的死亡，足以说明

hvKP

的高毒力性，高致死性。到目前为止，没有任何一种方法可以区分

hvKP

和

cKP

，多以表型呈现高黏液性作为高毒力的标志，但是有研究指出某些菌落的表型不是高黏性也拥有强的毒力，故本研究从基因水平，以

aerobactin

基因阳性为标志，共筛选出57株

hvKP

。通过药敏实验表明，57株

hvKP

对临床大多数抗生素比较敏感，耐药率较低，与国内研究一致，其原因可能是因为菌株表面拥有一层厚厚的荚膜使菌株难以获得耐药质粒且毒力基因和耐药基因的不相容性导致其对临床常用抗生素敏感，另外已有多篇文献曾报道过KP在具有高毒力特性的同时又对临床常用抗生素广泛耐药，但本研究未发现具有高毒力的同时又对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株。经过PCR技术检测荚膜血清型和毒力基因显示，血清型K1、K2型检出率最多，K1、K2型是

hvKP

最常见血清型。此外，本研究还显示K1型检出阳性的菌株，

wcag

、

magA

基因也检测出阳性，说明编码K1型血清型基因和编码

wcag

、

magA

基因位于同一质粒上，与Yeh et al研究一致。在8个毒力基因检出情况看，

fimH

、

mrkD

检出率最高，在每个菌株中都能检出这两种基因，与Zhao et al研究一致。说明

fimH

、

mrkD

并不能成为区分

cKP

和

hvKP

的标志，且2种基因都属于菌毛黏附蛋白，可以介导菌株和机体细胞的黏附作用，增强菌株的毒力作用。

rmpA

基因是荚膜多糖调节基因，可以上调荚膜多糖表达量，使菌落呈现黏液型。铁作为参与细胞氧化还原的一种离子，是细胞完成各种生化反应不可或缺的物质，

aerobactin

基因编码一种铁载体，菌株将铁载体分泌到体液中竞争结合存在于血液中的铁离子，并通过铁载体结合蛋白摄取铁载体，以此增强其毒力的表达，且表达不受温度影响，此外，

aerobactin

基因阳性的

hvKP

可以使其毒力增强100倍，这也是本研究以此基因阳性作为区分

hvKP

与

cKP

的标志基因的原因之一。

图3 亚抑菌浓度头孢西丁、阿米卡星作用下rmpA、aerobactin基因相对表达量

图4 57株hvKP的MALDI-TOF MS聚类分析图

最低抑菌浓度是指在体外环境培养细菌18～24 h，可以抑制细菌生长的最低药物浓度，低于此浓度定义为亚抑菌浓度。头孢西丁与阿米卡星的抗菌机制虽然不同，但是本研究在对3组亚抑菌浓度(1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC)的2种抗生素与菌株作用下毒力基因mRNA水平的变化发现，无论是

rmpA

还是

aerobactin

基因，转录水平都受到不同程度的抑制，且1/2MIC时受到的抑制最强，其次是1/4MIC及1/8MIC。值得注意的是本研究表明有4株菌在亚抑菌浓度阿米卡星作用下，毒力基因

aerobactin

的mRNA水平并没有受到抑制，反而增强，其原因可能是细菌为了适应抗生素带来的选择压力，主动调高

aerobactin

基因的表达，以分泌更多的铁载体来竞争周围存在的铁离子，以此提高菌株的生存能力，不过该基因表达升高的具体的机制需要进一步研究探索。通过对处理组之间进行统计分析可以发现，随着最低抑菌浓度的降低，2种毒力基因在转录水平都有不同程度的升高趋势，虽然有2组比较没有统计学差异，其原因可能是受到了标本量小的缘故，在接下来的研究中应该扩大标本量。分子生物学方法ERIC-PCR同源性分析将57株菌株分为19个型别，最多的一型有6株，其次是5株，可以说明57株

hvKP

亲缘关系较远，MALDI-TOF MS将菌株分为3型，Ⅰ型内的12株同源性较好，Ⅱ型、Ⅲ型内包含的45株菌株因质谱图谱相似性<70%，同源性较差，和ERIC-PCR结果相一致。因此在亚抑菌浓度头孢西丁和阿米卡星作用下，

rmpA

和

aerobactin

基因在转录水平受到抑制作用具有普遍性。虽然目前对亚抑菌浓度抗生素对

hvKP

毒力影响的研究较少，但是以往就有相关学者对亚抑菌浓度对

KP

的其他方面进行过研究。Nomura et al的研究表明，亚抑菌浓度的β内酰胺类抗生素可以使

KP

荚膜的厚度变薄，细胞表面疏水性变大，从而增强吞噬细胞对

KP

的吞噬作用，而亚抑菌浓度的喹诺酮类，氨基糖苷类抗生素对

KP

的影响较小。同时本研究显示，巨噬细胞对亚抑菌浓度头孢地嗪处理后的

KP

的吞噬作用比其对头孢噻肟和头孢哌酮处理后的

KP

吞噬作用更强,头孢哌酮及头孢噻肟对

KP

的毒力影响也很小。Lo Bue et al研究也证实，亚抑菌浓度的环丙沙星对引起尿路感染的79%致病性大肠埃希菌的菌毛蛋白有抑制作用,本研究结果与其一致。Ricci et al的研究同样证实，亚抑菌浓度的利福昔明对奇异变形杆菌和

KP

以及检测的所有铜绿假单胞菌脲酶的产生均受到了严重的影响，而且也抑制了铜绿假单胞菌的外毒素的产生。NamiKawa et al的研究表明，亚抑菌浓度的利福平对

hvKP

具有很强的抗黏液特性，当用利福平培养细菌时，

hvKP

的多糖提取物显示出大大降低的黏度。此外，该研究通过显微镜观察表明，利福平导致

hvKP

细胞周围的荚膜层厚度急剧减少，同时利福平处理降低了

rmpA

和

rmpA

调节的荚膜基因的转录水平，表明利福平通过抑制

rmpA

转录来抑制

hvKP

的黏膜黏度。这些数据表明，处在亚抑菌浓度利福平作用下的

hvKP

，其毒力基因表达受到了抑制作用，本研究的结论与之有某种程度上的相同。目前对

hvKP

处于亚抑菌浓度抗生素的环境中毒力表达变化的研究甚少，本研究得出的结论可以丰富目前对

hvKP

的认识，为临床医师合理应用抗生素、治疗由

hvKP

引起的感染提供依据。