海马CRHR1受体介导妊娠期慢性应激致子代雄性小鼠抑郁

张 阔，陈 鹏，钱志侃，陶 龙，姚余有，3

抑郁症是一种常见的、令人虚弱的潜在致命精神疾病。抑郁症患者核心症状为情绪低落、思维迟缓、意志活动减退，还可能出现睡眠障碍、反复自杀念头等。抑郁症的发病原因尚未完全阐明，众多研究显示，前额叶皮层、海马、杏仁核和下丘脑等部位异常与抑郁的发病有关。课题组的前期研究显示妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁，侧脑室注射促肾上腺皮质激素释放激素受体1(corticotropin-releasing hormone receptor1，CRHR1)拮抗剂可改善妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁程度。由于CRHR1广泛分布于大脑皮层、海马、杏仁核和下丘脑等多个脑区域，为了确定海马CRHR1是否介导妊娠期慢性应激致子代抑郁，该研究通过与江苏赛业公司共同建立了海马CRHR1基因条件性敲除鼠模型，利用海马CRHR1基因条件性敲除鼠进一步研究海马CRHR1是否介导妊娠期慢性应激致子鼠抑郁及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

从江苏赛业生物公司引进2只雌性mCrhr1 CK877-tsd-2D12 flox/+小鼠和2只雄性mCrhr1 CK877-tsd-2D12 flox/+小鼠以及一对特异性在小鼠海马CRHR1基因中表达CRE重组酶的Pomc-cre小鼠。小鼠品系为C57BL/6。实验动物引入安徽医科大学基础P2级动物实验室，在室温(24±1)℃和 50%的相对湿度下饲养，隔离观察1周未发现异常后转入饲养区，严格按照SPF级动物管理规定进行饲养和动物实验。

1.2 试剂与仪器

1.2.1

主要仪器 垂直电泳仪、转移槽、凝胶成像系统(北京Tanon公司)；ELX全自动酶标仪(美国BD公司)；Centrifuge5424R冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；强迫游泳图像采集及分析系统(上海欣软公司)；正置荧光显微镜(德国徕卡仪器有限公司)；扩增仪(美国ThermoFisher公司)；DNA电泳槽(上海天能科技有限公司)。

1.2.2

主要试剂 mTOR单克隆抗体、p-mTOR(Ser2448)单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；山羊抗兔IgG抗体(中杉金桥公司)；总蛋白BCA测定试剂盒(上海碧云天生物有限公司)；β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；TUNEL试剂盒(上海罗氏制药有限公司)；DNA引物(英潍捷基上海贸易有限公司)；小鼠CRHELISA酶联免疫试剂盒(上海江莱生物有限公司)。

1.3 海马CRHR1基因特异性敲除小鼠的繁育方案及分组

小鼠的繁育方案如下：♂/♀flox杂合子小鼠(flox/+)与♀/♂flox杂合子小鼠(flox/+)交配后获得flox纯合子小鼠(flox/flox)；同时♂/♀(flox/+)小鼠与♀/♂Pomc-cre小鼠交配后获得CRHR1基因条件性敲除杂合子小鼠(flox/+，with

cre

)；最后♀(flox/flox)小鼠与♂(flox/+，with

cre

)小鼠交配可产生(flox/flox，with

cre

)小鼠(CRHR1基因敲除纯合子，CKOA组)、(flox/+，with

cre

)小鼠(CRHR1基因敲除杂合子，CKOH组)以及(flox/flox，no

cre

)小鼠(CRHR1基因表达正常)和(flox/+，no

cre

)小鼠(CRHR1基因表达正常)。小鼠鉴定方法为酚氯仿法提取DNA测定子代小鼠基因型。实验时，选取30只8周龄(flox/flox)小鼠雌鼠(CRHR1基因正常表达)与15只8周龄(flox/+，with

cre

)小鼠雄鼠(CRHR1基因条件性敲除)在20：00以雌雄2:1合笼，第2天07：00查阴栓，检查到阴栓的将其分出单笼喂养，记为怀孕的第1天。常规饲养1周后选择15只孕鼠进行慢性不可预测性温和应激(the chronic unpredictable mild stress，CUMS)。应激方式包括：①夜间照明12 h；②禁水24 h；③温水游泳5 min；④束缚应激2 h；⑤禁食24 h；⑥夹紧尾巴5 min；⑦冷水游泳5 min；⑧笼倾斜45°角24 h。自孕第7天开始，每天使用抽签法随机选择1种应激方式(如与前1天相同，重新抽签)直至孕鼠分娩，这种应激方式可以引起孕鼠HPA轴激活，避免孕鼠产生应激耐受性。子鼠出生后依据其基因型选取雄性子鼠(酚氯仿法提取DNA测定子代小鼠基因型)，分为妊娠期正常对照+子代基因正常组(CON组)、妊娠期正常对照+子代CRHR1基因敲除杂合子组(CON+CKOH)、妊娠期正常对照+子代CRHR1基因敲除纯合子组(CON+CKOA)、妊娠期慢性应激+子代基因正常组(CUMS组)、妊娠期慢性应激+子代CRHR1基因敲除杂合子组(CUMS+CKOH)、妊娠期慢性应激+子代CRHR1基因敲除纯合子组(CUMS+CKOA),每组

n

=10。

1.4 行为学实验

1.4.1

强迫游泳测试(forced swimming test，FST) 实验第1天，将每组中的10只小鼠进行预实验，将小鼠置于直径20 cm玻璃桶中游泳15 min(水深30 cm，水温24 ℃左右)。第2天，将小鼠置于桶中游泳6 min，拍摄小鼠在桶中的运动情况，统计后4 min不动时间总和。

1.4.2

悬尾实验(tail suspension test，TST) 实验时，从每组中随机选出10只小鼠，用夹子(夹子中塞棉花)夹住小鼠尾部距尾尖2 cm处，随后将其悬挂在实验箱内，录像机记录其6 min中内的动态变化，统计6分钟内后4 min的不动时间总和。

1.4.3

糖水偏好实验(sucrose preference test，SPT) 实验第1天，从每组中随机选出10只小鼠进行预实验，在每个笼子两侧放2瓶1%蔗糖水(50 ml的透明玻璃瓶)。第2天，禁食、禁水1 d。第3天，每个笼子一侧放1瓶1%蔗糖水，另外一侧放1瓶纯净水。称重并记录1%蔗糖水和纯净水消耗量。实验结束后，分析得到数据并且计算糖水偏好值=(糖水前后重量差值/总液体前后重量差值)×100%。

1.5 Western blot法测海马组织mTOR和p-mTOR(Ser2448)蛋白含量

行为学实验结束后，每组取4只鼠，冰上取脑，分离出海马组织，根据BCA蛋白浓度测定试剂盒的操作说明测定海马总蛋白浓度。根据测出的蛋白总量确定上样量，8%SDS-PAGE用于分离样品，然后经过上样，电泳(120 V，180 min)，转膜(250 mA，4 h)，封闭(5%脱脂奶粉)，一抗(兔单抗，1∶1 000)4 ℃过夜，TBST洗膜，二抗(羊抗兔，1∶2 000)孵育，TBST洗过后加入显影液进行ECL显色，测其吸光度值分析结果。以β-actin为内参。

1.6 TUNEL法测海马CA3区椎体神经元的凋亡指数

将海马组织用石蜡包埋，切片后得到石蜡切片，然后经脱蜡水化，3%过氧化氢甲醇浸洗10 min，滴加蛋白酶K(20 μg/ml)工作液，37 ℃ 15 min，PBS清洗后滴加新鲜配置的TUNEL反应混合物，37 ℃避光孵育60 min，PBS清洗后滴加DAPI细胞染色液复染，避光孵育10 min，在荧光显微镜下(×200)观察。统计TUNEL染色阳性的细胞与细胞总数，计算两者比值即为AI。

2 结果

2.1 CRHR1条件性敲除对妊娠期慢性应激的子代雄鼠行为学影响

强迫游泳和悬尾实验结果显示，CON组、CON+CKOH组和CON+CKOA组的小鼠强迫游泳和悬尾不动时间差异无统计学意义；与CON组相比，CUMS组、CON+CKOH组和CON+CKOA组小鼠强迫游泳和悬尾不动时间均较长(

P

<0.05)；与CUMS组相比，CUMS+CKOA组小鼠强迫游泳和悬尾不动时间减少(

P

<0.05)；与CUMS+CKOH组相比，CUMS+CKOA组不动时间也减少(

P

<0.05)。但CUMS组和CUMS+CKOH组间小鼠强迫游泳和悬尾不动时间差异无统计学意义。见图1、2。

图1 妊娠期慢性应激对不同组别小鼠强迫游泳不动时间的影响

图2 妊娠期慢性应激对不同组别小鼠悬尾实验不动时间的影响

糖水偏好实验结果如图3所示。CON组、CON+CKOH组和CON+CKOA组小鼠糖水偏好率差异无统计学意义；与CON组相比，CUMS组小鼠糖水偏好率降低(

P

<0.05)；与CUMS组相比，CUMS+CKOH组和CUMS+CKOA组糖水偏好率上升(

P

<0.05)。此外，CUMS+CKOH组与CUMS+CKOA组间小鼠糖水偏好率差异也有统计学意义(

P

<0.05)。

图3 妊娠期慢性应激对不同组别子鼠糖水偏好率的影响

2.2 CRHR1条件性敲除对妊娠期慢性应激的子代雄鼠海马锥体神经元凋亡的影响

在正置荧光显微镜(×200)下观察每张切片，选取小鼠海马CA3区4个视野进行计数，DAPI染色的细胞核呈蓝色，TUNEL染色的细胞核呈绿色，统计TUNEL染色阳性的细胞与细胞总数，计算AI。TUNEL染色实验结果如图4所示。与CON组相比，CUMS组小鼠TUNEL染色阳性细胞数目增多，凋亡指数升高(

P

<0.05)；与CUMS组相比，CUMS+CKOA组小鼠TUNEL染色阳性细胞数目减少，凋亡指数降低(

P

<0.05)。但CUMS组和CUMS+CKOH组间凋亡指数差异无统计学意义。

2.3 CRHR1条件性敲除对妊娠期慢性应激的子代海马mTOR、p-mTOR(Ser2448)蛋白表达影响

采用Western blot方法检测海马脑组织中mTOR和p-mTOR蛋白含量，结果如图5和图6所示。CON组、CON+CKOH组和CON+CKOA组小鼠海马mTOR和p-mTOR表达量差异无统计学意义；与CON组相比，CUMS组、CUMS+CKOH组和CUMS+CKOA组小鼠海马mTOR和p-mTOR表达量均较低(

P

<0.05)；与CUMS组相比，CUMS+CKOA组小鼠海马mTOR和p-mTOR表达量升高(

P

<0.05)，但CUMS+CKOH组与CUMS组相比小鼠海马mTOR和p-mTOR表达量差异无统计学意义。

图4 不同组海马CA3区锥体神经元凋亡的

图5 不同组子鼠海马mTOR蛋白水平

3 讨论

海马是抑郁症研究中最常研究的大脑区域之一。研究表明，抑郁症发病机理可能与海马体积缩小，海马神经元的减少、可塑性降低等有关。以往的研究显示，CRH可经CRHR1致海马神经元树突棘损伤，本课题组的前期研究显示侧脑室注射CRHR1拮抗剂可改善妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁，但由于CRHR1广泛分布在皮层，海马和杏仁核和下丘脑等部位，故以往结果不能确定是哪个组织的CRHR1介导了妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁，因此，本文利用海马CRHR1基因条件性敲除鼠，进一步研究海马CRHR1是否介导妊娠期慢性应激致子鼠抑郁及机制。

图6 不同组子鼠海马p-mTOR蛋白水平

该研究采用慢性不可预测性温和应激进行实验，目的是避免孕鼠对单一应激产生了适应性。FST和TST是基于绝望的行为学检测方法，SPT是基于奖赏的行为学检测方法，均是反映抑郁模型抑郁程度的指标。在FST和TST实验中不动时间越长，表明小鼠抑郁程度越重；在SPT实验中糖水偏好率越低也表示小鼠抑郁程度越重。海马CRHR1基因条件性敲除鼠行为学实验结果显示：在FST和TST实验中，与CON组相比，CUMS组、CUMS+CKOH组和CUMS+CKOA组不动时间均增长，而与CUMS组相比，CUMS+CKOA组的不动时间减少；在SPT实验中，与CON组相比，CUMS组、CUMS+CKOH组和CUMS+CKOA组糖水偏好率均下降，而与CUMS组相比，CUMS+CKOH组和CUMS+CKOA组的糖水偏好率上升。这些结果表明，海马CRHR1的全缺失或半缺失会降低妊娠期慢性应激所引起的子代的抑郁程度，说明海马CRHR1参与了妊娠期慢性应激致子代抑郁。

以往研究显示海马CA3区与抑郁样行为存在密切关系，本研究TUNEL试验结果显示，与CON组相比，CUMS组、CUMS+CKOH组和CUMS+CKOA组海马CA3区TUNEL染色阳性细胞数量均增多，凋亡指数增高(

P

<0.05)；与CUMS组相比，CUMS+CKOA组凋亡指数下降(

P

<0.05)，提示妊娠期慢性应激可能经海马CRHR1引起海马神经元凋亡，导致子代抑郁。

mTOR是一种普遍表达的丝氨酸-苏氨酸激酶，它感知并整合了多种细胞内的环境线索，以协调细胞生长和代谢等主要过程。研究发现，激活mTOR通路，可通过上调多种相关蛋白的磷酸化水平，提高神经元的可塑性，产生抗抑郁效果。本次研究结果显示，与CON组相比，CUMS组海马mTOR和p-mTOR蛋白表达量显著下降；与CUMS组相比，CUMS+CKOA组小鼠海马mTOR和p-mTOR蛋白表达量显著增加，这说明海马CRHR1的敲除可以上调妊娠期慢性应激引起的下降的mTOR和p-mTOR蛋白表达水平，mTOR通路被激活，海马神经元凋亡程度下降。

该研究表明海马CRHR1基因敲除可以改善妊娠期慢性应激引起的异常的子代雄鼠的行为学、病理以及mTOR和p-mTOR蛋白表达，但未能使子代的上述指标恢复至正常子鼠水平，这提示除海马外，可能还有其他相关的脑部区域发挥着重要作用，杏仁核和前额皮层的CRHR1受体是否也参与妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁，有待进一步研究。