依布硒啉对多重耐药金黄色葡萄球菌的杀伤效果研究

谭 超 邹黎黎

(1. 天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)， 湖北 宜昌 443002； 2. 三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 输血科， 湖北 宜昌 443003)

多重耐药菌(multidrug-resistant organism，MDRO)主要是指对临床使用的三类或三类以上抗菌药物同时呈现耐药的细菌[1]。在临床上常引起呼吸道、血液、尿路以及伤口等部位的感染，呈现复杂性、难治性等特点。其治疗难度在逐步加大、导致感染的病死率逐渐增高、临床病程及治疗费用也在延长和增加，是医院需要防控的重要病原菌[2]。金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus, SA)是临床上常见的医院感染菌，自1961年发现耐甲氧西林金葡菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)以来，多种多重耐药菌株不断被发现，其导致的多重耐药感染逐渐成为临床诊治的难点[3]。因此，研发新的抗生素作用靶点，特别是无法产生耐药性的靶点，对缓解日益严重的耐药性细菌感染具有重要临床意义。

依布硒啉(2-苯基-1,2-苯丙异硒唑-3(2H)-酮，Ebselen)，最早作为一种含硒的脂溶性有机小分子化合物合成于德国[4]。它是第一个被报道的具有谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)类似物活性的有机硒化合物分子[5]。因其体内外的抗氧化、抗炎特性在1997被日本Daiichi制药公司作为中风治疗药物用于III期临床实验，并在免疫系统功能紊乱、抗炎、抗动脉粥样硬化、治疗脑缺血等方面均表现出良好的治疗效应[4,5]。Ebselen可在多种感染过程中下调机体的炎症反应，同时对病原菌造成氧化损伤，发挥抗炎杀菌活性，是一种理想的抗生素候选物。

基于此，本研究从临床分离了108株多重耐药性金黄色葡萄球菌，对其耐药情况进行分析，并探讨Ebselen的杀菌效果及作用位点，以期为公共卫生及药理学领域的相关科研工作者提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

收集2019年1月～2019年12月我院住院患者送检的各类临床细菌培养标本，分离、纯化并剔除同一患者相同部位的重复菌株。经革兰氏染色镜检为革兰氏阳性球菌。进一步通过凝固酶试验，梅里埃Vitek2 Compact全自动微生物分析仪和梅里埃Vitek MS质谱仪鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株。再采用OXOID公司生产的头孢西丁等12种药敏K-B纸片扩散法，药敏结果按2017年美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的标准判断[6]，判定108株金黄色葡萄球菌为多重耐药菌。同时，选取金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923(Microbiologics，美国)作为对照。

1.2 材料

Ebselen(TargetMol，美国)，BCA试剂盒(碧云天)，硫氧还蛋白(Cayman，美国)，乙二胺四乙酸(EDTA)(上海沪试)，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)(Roche Diagnostics，瑞士)，5’, 5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)(Sigma，美国)，LB培养基(Thermo，美国)，96孔板(Corning，美国)，Vitek2 Compact全自动微生物分析仪(法国)，梅里埃革兰阳性菌生化鉴定卡(法国)，梅里埃Vitek MS质谱仪(法国)，全波长Multiskan Spectrum酶标仪(Thermo，美国)。

1.3 微孔法合并涂板计数法观察Ebselen对金黄色葡萄球菌生长的情况

将临床分离鉴定，并进行药敏实验后的菌株置于LB培养基中震荡培养4～6 h，培养至对数生长期，采用全波长Multiskan Spectrum酶标仪调整OD600 nm=0.4，再用LB培养基将调整后的菌液1∶100稀释后用于下游实验。

于96孔板的微孔中加入100 μL菌液，再加入100 μL浓度梯度Ebselen(0，2.5，5，10，20，40 μM)，混匀后置于37℃培养箱连续培养。培养16 h后通过全波长Multiskan Spectrum酶标仪测定细菌的生长情况。

1.4 DTNB实验测定Ebselen对金黄色葡萄球菌硫氧还蛋白还原酶活性的影响

将生长过夜的菌液转接至新LB培养基培养至对数生长期，用全波长Multiskan Spectrum酶标仪调整OD600 nm=0.4。在15 mL摇菌管中加入5 mL菌液，再加入80 μM Ebselen，混匀后置于37℃培养箱培养30 min。于4℃、10 000 rpm离心5 min收集菌体，PBS洗涤3次，重悬于 50 mM Tris-EDTA(pH 7.4)缓冲液中。将收集获得的菌体超声波破碎(240 W，10 s，间隔3 s，共计5 min)后，4℃、12 000 rpm离心20 min收集上清液，通过Bradford试剂盒测定蛋白浓度。在96孔板中加入25 μg细菌蛋白，加入2 mM EDTA和200 μM NADPH于37℃ 孵育5 min。随后加入5 μM 硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)和2 mM DTNB进行孵育，于412 nm 处测定5 min连续吸光值，计算斜率以代表细菌硫氧还蛋白还原酶(bacterial thioredoxin reductase, TrxR)活性(未处理组的TrxR活性计为100%)。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行数据处理，MIC两两比较采用Student’st-test检验，TrxR百分数两两比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床108株多重耐药金黄色葡萄球菌的耐药情况分析

根据药敏结果数据整理，本次收集到的108株金黄色葡萄球菌全部为多重耐药菌，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的比例高达78.70%(见表1)。

2.2 Ebselen对108株临床多重耐药金黄色葡萄球菌的杀菌效果

使用微孔和涂布法检测Ebselen对临床分离得到的多重耐药金黄色葡萄球菌菌株的杀菌效果。如表2所示，Ebselen对本次分离得到的108株耐药菌株(编号001～108)均表现出理想的杀菌效应。其中，对编号010为代表的菌株最敏感，使用浓度为5 μM，与MIC为2.5 μM的标准株ATCC25923相比，具有统计学差异(P<0.005)；对编号094为代表的菌株最不敏感，使用浓度为40 μM，与标准株相比，具有统计学差异(P<0.000 1)。

表1 108株临床金黄色葡萄球菌的耐药率分析

表2 Ebselen对108株临床多重耐药金黄色葡萄球菌菌株的MIC

表3 Ebselen对108株临床多重耐药金黄色葡萄球菌TrxR活性的影响

2.3 Ebselen对108株临床多重耐药金黄色葡萄球菌TrxR活性的影响

使用DTNB法检测Ebselen对108株临床多重耐药金黄色葡萄球菌TrxR活性的影响。如表3所示，Ebselen可靶向抑制本次分离得到的108株耐药菌TrxR的活性。实验将未加入Trx蛋白组的吸光值作为背景，用未加入Ebselen组(对照组)的吸光值扣除背景后得到的值记为TrxR活性并设置为100%。在此基础上，进一步计算Ebselen处理后的各多重耐药金黄色葡萄球菌的TrxR活性。结果显示，Ebselen处理组的TrxR活性为8.3%～51.9%，与对照组相比具有统计学差异(P<0.000 1)。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是社区获得性感染的常见病原菌，可产生多种毒素，在临床上具有很强的致病能力[7]。而随着广谱抗菌药物的大量使用，金黄色葡萄球菌对多种抗菌药物呈现耐药性，极大地限制临床用药的选择，增加了临床患者的病死率和疾病负担[8]。

Trx是广泛存在于生物体内，高度保守的氢载体小分子蛋白，相对分子质量约为12 kDa，在细胞中以氧化态和还原态的形式存在，是绝大多数革兰阳性细菌(谷胱甘肽系统缺失细菌，GSH-negative bacteria)合成DNA及RNA的唯一供电子和抗氧化关键系统[9,10]。哺乳动物TrxR是一种以头对尾方式排列的二聚体酶，含有两个相对分子质量为55 kDa的亚基，分为胞质TrxR1、线粒体TrxR2、睾丸特异性TrxR3等3种形式；而细菌TrxR的两个亚基相对分子量仅为35 kDa，缺少界域面[11,12]。两者在分子量，结构上的天然差异，使得细菌的TrxR成为某些抗生素发挥差异性毒力的作用靶标。值得注意的是，在生理情况下，氧化态的Trx(oxidized Trx)可被TrxR还原为还原态Trx(reduced Trx)[13]。而Ebselen是一种人工合成，具有广泛生理药理活性的脂溶性含硒有机小分子化合物，对耐药性金黄色葡萄球菌的杀伤作用主要依赖于其靶向作用于Trx活性位点的二硫醇Cys135-Cys138，有效阻断电子从NADPH传递至Trx，造成细菌胞内高氧化态，诱导和加速细菌死亡[14,15]。

本团队前期研究发现，Ebselen可作为哺乳动物TrxR的底物，显著提高TrxR还原活性氧(reactive oxygen species, ROS)的能力[16]。同时，Ebselen又可作为竞争性抑制剂，阻断细菌TrxR电子传递能力，妨碍其还原能力的发挥，从而升高胞内ROS，达到杀菌目的[16]。Dong等[17]在大鼠模型中评估了Ebselen对葡萄球菌性皮肤感染的局部治疗效果，发现Ebselen可显著降低金黄色葡萄球菌皮损的细菌负荷和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6 (interleukin-6，IL-6)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的表达，且与对照组相比，Ebselen治疗组的伤口愈合和病理改变均有明显改善。Thangamani等[18]的研究也证实，Ebselen对临床分离的耐多药金黄色葡萄球菌显示了强大的杀菌活性，包括耐甲氧西林和万古霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA和VRSA)，通过抑制MRSA中蛋白质的合成进而抑制毒素的产生和体外生物膜的形成。

本研究在前期研究基础上，收集了我院108株耐多药金黄色葡萄球菌。使用微孔和涂布法证实了Ebselen对临床分离得到的多重耐药金黄色葡萄球菌菌株的MIC为5～40 μM，具有良好的抗菌活性。并进一步使用DTNB试验证实了Ebselen是通过降低细菌胞内TrxR的活性，实现对耐药性金黄色葡萄球菌的杀伤作用。鉴于Ebselen目前已作为治疗中风的药物进入III期临床试验，具有较好的人体耐受性与较低的毒性[19]。开发其在杀菌方面的效用，属于“老药新用”，极大地降低了研发成本，可能是一种较为理想的潜在抗菌药物。