鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌的作用及机制

韩 蜜，陈 镇，朱镇华，龙运雄，欧阳林旗，伍梦玲，邓桂明

（1.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007；2.湖南省肿瘤医院，长沙 410013）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是指发生在鼻咽腔顶部及侧壁部位的恶性肿瘤，是中国南方地区高发的恶性肿瘤，具有家族遗传倾向，与EB病毒的感染有关。其发病率位居头颈部恶性肿瘤之首。目前，临床治疗鼻咽癌的方法主要包括放疗、化疗、同步放化疗等。因鼻咽部位处于头颅中央，与周围重要的组织和器官关系非常密切，因而鼻咽癌常出现淋巴结转移，手术难以完全切除病灶，而鼻咽癌对放射线高度敏感，因此放疗成为临床治疗鼻咽癌最主要的手段。但放疗在有效治疗鼻咽癌的同时也会引起放射性皮肤损伤、唾液腺损伤、放射性耳鼻损伤等一系列局部不良反应，还会引起白细胞数量减少、头痛头晕、贫血、腹痛腹胀等全身不良反应［1］。因此，寻找价廉、安全、副作用小的治疗药物是临床所需。与化学药物相比，中药复方在控制预防复发、减毒增效、肿瘤增殖、改善生活质量、延长生存期等方面具有独特的优势［2］。

鼻咽解毒胶囊为湖南中医药大学第一附属医院自研制剂，由黄连、黄芩、黄芪、白花蛇毒草和甘草五味药制成的中药复方制剂，具有清热解毒、扶正培本之功效，主要用于鼻炎、鼻咽癌和EB病毒阳性的鼻咽癌高危人群抗病毒治疗。现代药理研究证明，黄连具有较强的抗菌作用，而且抗菌谱较广，在抗肿瘤方面具有良好的前景；黄芩具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、抗氧化及良好的改善心血管功能的作用，抗肿瘤的作用日益受到人们的重视；黄芪中的黄芪多糖具有抗肿瘤、促进抗体合成、促进免疫、增强机体抵抗力等多种作用［3，4］；白花蛇舌草含黄酮类化合物、环烯醚萜类化合物、蒽醌类化合物等，可抑制肿瘤细胞增长并诱导其凋亡和清热解毒、化瘀利尿等功效［5，6］；甘草具有抗肿瘤、抗病毒、抑制脂质过氧化和抗自由基氧化等多种生物学活性［7］。

网络药理学是基于系统生物学，从整体上分析中药复方的药效物质基础和分子作用机制；分子对接法是研究药物中化合物和蛋白受体之间的作用，并能预测配体-受体亲和力的一种方法。本研究使用网络药理学和分子对接方法，从分子层面探讨鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌的具体机制，为鼻咽解毒胶囊临床应用提供坚实的理论基础，为新药的开发提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、GeneCards（https：//www.genecards.org/），OMIM（https：//www.omim.org/）、Venny 2.1、String（https：//stringdb.org/cgi/input.pl）、Cystoscap 3.6.0、Cytoscape3.7.2、NetworkAnalyzer、R3.6.3等。

1.2 鼻咽解毒胶囊活性成分及其对应靶点本研究通过中药系统药理学分析平台TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以单味药黄连、黄芩、黄芪、白花蛇舌草和甘草的标准中文名称或拉丁文为检索词，以口服生物利用度（OB）≥30% 及类药性（DL）≥0.18为筛选条件获取中药活性成分和靶点。

1.3 疾病靶点收集与Venny图的绘制以鼻咽癌的英文名“nasopharyngeal carcinoma”为关键词，在GeneCards（https：// www.genecards.org/）数据库和 OMIM数据库（https：//www.omim.org/）进行靶点检索，将两个数据库检索到的基因合并删重。将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，获得鼻咽解毒胶囊的靶点与鼻咽癌靶点的交集图，从而得到鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌的潜在作用靶点。

1.4 中药-成分-靶点-疾病网络构建为了更好的理解中药、成分与其相应靶点之间的复杂相互作用关系，应用Cytoscape3.7.2软件，以纳入的复方中药、对应的中药成分、治疗疾病以及作用靶点为基础，构建了中药-成分-靶点-疾病网络图。

1.5 PPI网络构建及拓扑分析将药物疾病共有靶点输入String数据库（https：//string-db.org/cgi/input.pl）进行PPI网络的构建，将PPI网络导入Cystoscap 3.6.0中，通过NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析，以degree，betweenness centrality，average shortest path length 和 closeness centrality这四个参数为参考标准，通过degree排序。

1.6 GO 和 KEGG 分析将药物疾病共有靶点进行GO和KEGG通路富集分析，选择生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cell component，CC）三个模块，引用String 数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选。使用R 3.6.3 进行柱状图绘制。

2 结果

2.1 鼻咽解毒胶囊有效化合物及化合物作用靶点的收集通过 TCMSP 数据库搜集5种中药的化学成分和作用靶点，根据“OB≥30%、DL≥0.18”筛选后，黄连获得14个成分，167个靶点；黄芪获得20个成分，191个靶点；黄芩获得36个成分，106个靶点；白花蛇舌草获得7个成分，172个靶点；甘草获得93个成分，213个靶点，去掉重复的成分后得到156个化学成分，242个作用靶点。在GeneCards数据库和OMIM数据库以“nasopharyngeal carcinoma”为关键词进行疾病靶点检索，在Genecards数据库检索到1797个基因，在OMIM数据库检索到188个基因，将两个数据库检索到的基因合并删重后，总共得到1961个基因。通过 Venny2.1.0软件获取鼻咽解毒胶囊和鼻咽癌的作用靶点交集，结果发现交集靶点128个，约占交集总数的 6.2%，得到鼻咽解毒胶囊和鼻咽癌的 Venny 图，见图1。

2.2 构建中药-成分-靶点-疾病网络将鼻咽解毒胶囊活性成分与鼻咽癌-鼻咽解毒胶囊交集靶点导入Cytoscape3.7.2软件，构建了中药-成分-靶点-疾病网络图，见图2。网络中黄色为药物作用于疾病的靶点，蓝色为中药的有效活性成分，紫色为中药，红色为疾病即鼻咽癌。每条边表示疾病-药物所对应靶点、药物所对应化学成分以及药物化学成分与潜在作用靶点的相互作用关系。其中槲皮素（quercetin）、汉黄芩素（wogonin）、山奈酚（kaempferol）、黄芩素（baicalein）等15种活性所对应的靶点数目较多，说明它们可能是鼻咽解毒胶囊的关键活性成分，结果见表1。

表1 鼻咽解毒胶囊15种活性成分信息及对应靶点数目

2.3 PPI 网络构建与分析将药物疾病共有靶点输入String数据库进行PPI网络的构建，将PPI网络导入Cystoscap 3.6.0 中，PPI 网络（富集 P 值＜ 1.0e×10-16）包含 128 个节点，2693条边，节点的平均度值（degree）为 42.1。节点（node）表示蛋白，边（edge）表示蛋白之间的相互作用关系。依据节点度值大小，AKT1（105）、IL6（95）、CASP3（94）、VEGFA（94）这 4 个靶点蛋白可能在网络中起着关键作用。

图1 药物-疾病交集靶点 Venny 图

图2 中药-成分-靶点-疾病网络图

图3 鼻咽解毒胶囊-鼻咽癌交集靶点 PPI 网络

2.4 GO 与 KEGG 富集分析将 128 个鼻咽解毒胶囊 -鼻咽癌交集靶点导入String 数据库分别进行 GO 和 KEGG富集分析（限定物种：Homo sapiens；P＜0.05）。结果，共得到 GO 富集条目2357个，其中生物过程（biological process，BP）2188项，主要涉及腺体发育、类固醇激素反应、细胞对活性氧的反应等；分子功能（molecular function，MF）相关118项，主要涉及整联蛋白结合、MAP激酶活性、蛋白酶结合等；细胞组成（cell component，CC）相关51项，主要涉及核染色、蛋白激酶复合物、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物等。共得到 83 个 KEGG 富集条目，主要涉及多物种细胞凋亡通路、催乳素信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药机制。依据 P 值筛选排名前 10的 GO 富集分析和排名前 20 的 KEGG 富集分析，使用R 3.6.3 进行柱状图绘制（图4、图5）。

图4 鼻炎解毒胶囊-鼻咽癌交集靶点 GO 富集分析柱状图

图5 鼻咽解毒胶囊-鼻咽癌交集靶点 KEGG 富集分析柱状图

2.5 鼻咽解毒胶囊主要活性成分与对应靶点蛋白的分子对接验证利用AutoDock Vina 1.1.2对四个受体蛋白AKT1（PDBID ：4EKL）、CASP3（PDBID ：2J32）、IL6（PDBID ：1ALU）、VEGFA（PDBID：1VPF）与15个配体小分子槲皮素、汉黄芩素、山奈酚、黄芩素等分别进行分子对接，结合能打分及对接参数如表2所示，AutoDock Vina将结果以一种亲和能（Affinity）的形式输出，通过计算受体-配体复合物的空间效果、排斥作用、氢键、疏水相互作用以及分子的灵活性等值综合打分，评估其亲和力，最终给出亲和能打分，这种亲和能是衡量配体是否能与受体分子有效结合的重要指标，是AutoDock Vina软件的核心参数，能值越低，二者的结合效果越好。

采用分子对接的方法将每个受体蛋白与结合能最低的配体进行做图，即将受体蛋白AKT1与光甘草定配体小分子、受体蛋白CASP3与黄芩素配体小分子、受体蛋白IL6与槲皮素配体小分子、受体蛋白VEGFA与3′-羟基-4′-O-甲基光甘草定配体小分子之间的结合模式做图。图A为受体蛋白AKT1与光甘草定配体小分子之间的结合模式，氨基酸残基Asp292与光甘草定配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基 Glu278、Glu234、Gly157、Lys158、Val164、Gly159、Lys179、Phe161、Leu181、Thr195、Ile186、Glu191、His194与光甘草定配体小分子形成疏水相互作用。图B为受体蛋白CASP3与黄芩素配体小分子之间的结合模式，氨基酸残基Arg64、Arg207、Gln161、His121与黄芩素配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基Ser120、Ala162、Glu123、Cys163、Ser205、Trp206与黄芩素配体小分子形成疏水相互作用。图C为受体蛋白IL6与槲皮素配体小分子之间的结合模式，氨基酸残基Asp34、Arg179与槲皮素配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残Gln175、Leu33、Arg30、Leu178与槲皮素配体小分子形成疏水相互作用。图D为受体蛋白VEGFA与3′-羟基-4′-O-甲基光甘草定配体小分子之间的结合模式，氨基酸残基Cys61、Asn62、Cys57、Asp63与3′-羟基-4′-O-甲基光甘草定配体小分子形成氢键相互作用，氨基酸残基Cys60、Gly59、Gly58、Cys68、Glu67、Leu66、Lys107、Glu64与3′-羟基-4′-O-甲基光甘草定配体小分子形成疏水相互作用。

表2 鼻咽解毒胶囊主要活性成分与对应作用靶点的分子对接

3 讨论

鼻咽癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，其发病病因可能与EB 病毒感染、遗传、环境等因素有关［8-10］。目前，治疗鼻咽癌的主要手段为放疗，但是放射线对人体细胞缺乏选择性，不但能杀灭癌细胞，还能杀灭正常细胞，损害机体的免疫功能。近年来，中药复方及单体有效成分的抗肿瘤作用越来越受到学者们的重视。鼻炎解毒胶囊是黄连、黄芩、黄芪、白花蛇毒草和甘草五味药制成的中药复方制剂，具有清热解毒、扶正培本之功效，本研究借助网络药理学及分子对接方法对其体内作用机制进一步阐明。

图6 分子对接模式图Fig.6 Pattern diagram of molecular docking

通过数据库筛选得到鼻炎解毒胶囊主要活性成分156个，治疗鼻咽癌的交集靶点128个，通过中药-成分-靶点-疾病网络图，degree排名靠前成分主要有槲皮素、汉黄芩素、山奈酚、黄芩素等。槲皮素具有多方面的生理活性，如抗炎［11］、抗癌［12］、抗病毒［13］、抗氧化［14］、预防和治疗心脑血管疾病［15］等。汉黄芩素可能通过抑制XIAP、Survivin、Bcl-2表达及促进Bax表达而发挥抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖并诱导细胞凋亡作用［16］。山奈酚能抑制多种肿瘤细胞的细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤组织的侵袭及转移［17］。黄芩素可以通过下调EB病毒蛋白EBNA1的表达，从而抑制EBV阳性鼻咽癌细胞的增殖生长。说明鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌可能是通过多种成分共同调控的。

PPI网络分析，degree排名靠前的靶点有AKT1、CASP3、IL6、VEGFA，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT Serine/Threonine Kinase 1，AKT1）是一种抗凋亡蛋白激酶，其底物之一是鼠双微体（2MDM2）蛋白，在细胞核中下调p53活性，从而在肿瘤的发生中起着重要作用。胱天蛋白酶 -3（Caspase 3，CASP3）是一种重要的凋亡成分，是细胞凋亡的关键分子，细胞凋亡的形态变化是一系列胱天蛋白酶活化并水解底物的结果，其异常功能或许在癌症发病机制中起关键作用［18］。白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）在EBV感染患者鼻咽组织巨噬细胞中表达，G等位基因是鼻咽癌复发的保护基因，IL6-634基因的GG基因型与鼻咽癌复发风险相关［19］。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）常通过触发血管反应引起病理障碍，包括组织水肿和病理血管生成［20］，VEGF-2578 C等位基因携带者患鼻咽癌的风险显著，VEGF-2578 C等位基因携带者与肿瘤大小和晚期肿瘤分期之间存在显著相关性［21］。分子对接结果发现15种配体小分子均与受体蛋白AKT1、CASP3、IL6、VEGFA中的氨基酸残基形成氢键和疏水作用。

通过GO富集分析发现鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌主要通过核染色、蛋白激酶复合物、整联蛋白结合、MAP激酶活性等过程，这些过程在治疗鼻咽癌作用靶点和作用通路上均有所体现。KEGG富集通路中，主要涉及多物种细胞凋亡通路、催乳素信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药机制等作用通路。本研究结果提示鼻咽解毒胶囊可能通过多靶点、多通路发挥药理作用起到抗鼻咽癌的作用。下一步将对所预测的关键靶点和通路进行科学验证。

同时，分子对接发现鼻咽解毒胶囊中15个主要活性成分槲皮素、汉黄芩素等与四个受体蛋白AKT1、CASP3、IL6、VEGFA有很好的结合，这些都为鼻咽解毒胶囊治疗鼻咽癌的实验研究提供了一定的方向。