MiR-186通过调控EZH2影响急性髓系白血病细胞增殖及凋亡

朱 娟，周 英，唐少华

（1.中南大学湘雅三医院检验科，长沙 410013；2.长沙市中心医院检验科，长沙 410004）

急性髓性白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是急性白血病中常见的类型之一，是临床髓系造血干/祖细胞恶性疾病，其主要特征为骨髓、外周血中原始及幼稚髓样细胞发生异常增生［1］。成人总体发病率75.3/10万人，死亡率53.4/10万人，发病率及死亡率在成人所有恶性肿瘤中位居第13位和第9位［2］。因此，研究AML发生发展的分子机制，提高AML的生存率，具有重要的临床意义。

微小 RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，约22nt，通过5’端6～8个序列（种子序列）与其靶基因的mRNA分子的3’端非编码区域（3’UTR）互补配对在转录后水平上对基因的表达进行负调控［3］。miRNA可导致mRNA的降解或翻译抑制，从而进一步调控多种生物学行为如发育的进程、干细胞分化、细胞凋亡、疾病以及肿瘤发生等［4］。研究表明，miR-186在慢性淋巴细胞白血病、自身免疫溶血性贫血、多发性骨髓瘤以及AML患者中均有表达下调，其低表达与患者的不良预后密切相关［5］，但其具体机制未见报道。因此，本研究对miR-186在AML细胞中的功能及作用机制进行探讨。

1 资料与方法

1.1 骨髓标本收集中南大学湘雅三医院和长沙市中心医院2018年8月～2019年8月血液科初诊为AML的患者骨髓标本（60例）。另外收集了20例正常供者骨髓标本作为正常对照。所有标本的使用获得了医院伦理委员会的同意和患者或家属的知情同意。

1.2 主要试剂TRIZOL购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，荧光定量PCR试剂盒购自罗氏公司，MTT试剂盒购自Sigma公司，mimicmiR-186和inhibitor-miR-186购自上海吉玛基因公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，EZH2及GAPDH抗体购自Abcam公司。

1.3 细胞培养人AML细胞HL60及人胚胎肾细胞HEK293购买自美国菌种保藏中心。两种细胞均置于RPMI-1640培养基中培养，培养基中添加10% FBS和1%青霉素/链霉素，置于5% CO2、37℃培养箱中培养。

1.4 荧光定量PCR使用TRIZOL提取总RNA。利用逆转录试剂盒进行逆转录，所有操作按试剂盒的使用说明进行。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪检测基因的表达，反应条件按荧光定量PCR试剂盒的操作说明进行。热循环参数为：95℃ 10s，然后95℃5s，60℃ 10s，72℃ 10s，共 45 个循环 ；最后72℃延伸5min。定量PCR每个反应设置3个重复。内参用U6或GAPDH。数据分析采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt=实验组（Ct目标基因-Ct内参）-对照组（Ct目标基因-Ct内参）。各基因及其内参的扩增引物序列详见表1。

表1 引物序列

1.5 细胞增殖实验MTT实验用来检测HL60细胞增殖能力。将目的细胞消化后接种到96孔板，每个孔接种约3000个细胞，每个样品接种3个孔，分别加入不同浓度阿霉素（0、0.1、1、2、5、10μg/mL）。培养箱中孵育24h后每个孔内加入10μL的MTT试剂。置于培养箱中继续孵育2h后，450nm波长处测定吸光值。

1.6 细胞凋亡实验采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。收集各组转染或/和阿霉素处理的细胞，PBS洗2次。用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10 min。加入5μL的Annexin V-FITC和5μL的PI，轻轻混匀，室温避光反应10 min。流式细胞仪检测FITC荧光和PI荧光，分析细胞凋亡率。实验设置3个重复。

1.7 靶基因预测及双荧光素酶试验通过starBase工具（http：//starbase.sysu.edu.cn/）预测miR-186与EZH2结合的位点。根据预测的结果，分别设计和合成结合位点的野生序列和突变序列（mut-EZH2和wt-EZH2）。分别将结合位点的野生序列和突变序列插入荧光素酶报告基因载体（pGL3-Basic）中，再分别与 miR-186 mimic（30 nM）或阴性对照（30 nM）共转染HEK239T细胞。 转染后检测各组Firefly荧光素酶活性和Renilla荧光素酶活性，Renilla荧光素酶活性作为内参，Firefly荧光素酶与Renilla荧光素酶活性的比值为荧光素酶的相对活性。

1.8 Western blot使用RIPA裂解液（碧云天，上海，中国）裂解细胞，获得蛋白样品。利用BCA试剂盒（碧云天）测量蛋白浓度后，取相应体积的蛋白加入上样缓冲液（碧云天）混匀，沸水浴加热3min，使蛋白变性。80 V电泳30min，待溴酚蓝进入分离胶后改用120 V，电泳1～2 h。转膜在冰浴中进行，转膜电流为300mA，时间为60min。转膜后把膜放入洗涤液中漂洗1～2min，再将膜放入封闭液中室温封闭60min，或者4℃封闭过夜。室温下，摇床上孵育一抗GAPDH、EZH2 1h，洗涤液洗涤3次，每次10 min。转入二抗中，室温下孵育1小时，洗涤3次，每次10min。在膜上滴加显影液后，利用化学发光成像系统（Bio-rad）进行检测。

1.9 统计分析使用SPSS 18.0进行数据统计学分析。计量数据采用平均值±标准差形式展示，两组之间的比较采用t检验，多组之间的比较采用One-way analysis of variance（ANOVA）检验。骨髓标本中 miR-186 表达的相关性采用Pearson相关系数。P＜ 0.05视为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AML中miR-186呈低表达状态，而EZH2呈高表达状态荧光定量PCR检测临床AML患者及对照组（健康志愿者）骨髓miR-186及EZH2的表达。结果显示：相较于健康志愿者，AML患者骨髓的miR-186明显下调（图1A），EZH2的mRNA水平显著升高（图1B）。

图1 miR-186与EZH2在健康志愿者和AML患者中的表达.（A）miR-186的相对表达量 ；（B）EZH2的相对表达量.**：与健康志愿者比较，P＜0.01

2.2 miR-186抑制HL60细胞增殖并促进其凋亡在HL60细胞中分别转染mimic-NC，mimic-miR-186，inhibitor-NC，inhibitor-miR-186，分别培养24，48，72h后，利用MTT法检测HL60细胞的增殖能力。结果表明：72h后，mimic-miR-186组的OD值明显低于mimic-NC组（图2A），inhibtor-miR-186组的OD值明显高于inhibitor-NC（图2B）。

同样，将上述各分组细胞通过流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示：mimic-miR-186组的凋亡率高于mimic-NC组，inhibitor-miR-186组的凋亡率低于inhibitor-miR-186（图2C）。以上结果表明，miR-186抑制HL60细胞增殖，促进其凋亡。

图2 miR-186抑制HL60细胞增殖，促进HL60细胞凋亡.细胞转染mimic-NC和mimic-miR-186后的增殖变化（A）和细胞凋亡变化（C）；细胞转染inhibitor-NC和inhibitor-miR-186后的增殖变化（B）和细胞凋亡变化（D）*：mimic-miR-186与mimic-NC比较，P＜0.05

2.3 miR-186与EZH2靶向结合针对Starbase中预测的miR-186与EZH2结合位点的序列，设计合成了结合位点的野生序列（wt）和突变序列（mut）（图3A），并插入荧光素酶报告基因载体中，验证miR-186与EZH2的靶向结合。结果显示，插入EZH2突变序列mut-EZH2后，共转染mimic-miR-186和mimic-NC荧光素酶活性没有差异；而插入EZH2野生序列wt-EZH2序列后，共转染mimic-miR-186荧光素酶活性显著低于共转染mimic-NC（图3B，P＜ 0.05）。这一结果表明，miR-186可与EZH2相结合。

图3 miR-186与EZH2靶向结合的预测及验证.（A）利用Starbase预测miR-186与EZH2的结合位点；（B）荧光素酶报告实验验证miR-186与EZH2的结合。mimic-miR-186与mimic-NC比较，**P＜0.01

3 讨论

本研究发现相比于健康志愿者，miR-186在AML患者中低表达，EZH2在AML患者中高表达。通过在HL60细胞中转染mimic-miR-186和inhibitor-miR-186对miR-186进行过表达及敲低，MTT法检测各组细胞增殖及流式细胞术检测各组细胞凋亡，发现miR-186抑制HL60细胞增殖促进其凋亡。且miR-186与EZH2的表达呈负相关。通过生物信息学方法在线预测miR-186与EZH2有靶向结合位点，并通过双荧光素酶实验进行验证，证明两者之间存在靶向结合的关系。以上结果表明，miR-186通过抑制EZH2的表达发挥抑制AML肿瘤细胞增殖的作用。

PRC（Polycomb Repressive Complex）可以通过调控多条信号通路在哺乳细胞的生长、分化等过程中发挥重要作用［6-7］。PRC2是调控干细胞活性的关键分子，PRC2的异常表达与包括白血病、胃癌等多种类型的肿瘤密切相关［8-9］。EZH2是PRC2最重要的催化亚基，参与调控细胞周期、增殖、分化等多个细胞生物学事件［10］。据报道，EZH2与乳腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、AML等肿瘤细胞增殖凋亡密切相关［11-14］。有临床研究显示：EZH2的表达与AML病人的不良预后密切相关，并调控肿瘤干细胞调控关键分子，包括Wnt/β-catenin、Notch、STAT3等信号通路［15］。

MiR-186是miRNAs的成员之一，位于染色体1p31.1，在锌指蛋白265基因的第8个内含子处，在包括非小细胞肺癌、前列腺癌、胃癌等多种实体瘤中表达下调［16-18］，可以促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。miR-186在慢性淋巴细胞白血病、自身免疫溶血性贫血、多发性骨髓瘤以及AML患者中同样表达下调，其低表达与患者的不良预后密切相关［19］。生物信息学研究显示，miR-186可以靶向EZH2。

我们研究的结果还表明，EZH2和miR-186在大多数患者中的表达呈负相关，但并不是在所有的患者中，表明除了EZH2，miR-186还会有其它潜在的未被发现的靶基因，一个miRNA调控多个基因，而一个基因受多个miRNA调控，因此形成了复杂的miRNA调控网络。

综上所述，本研究通过在AML中研究miR-186的表达和功能，miR-186通过靶向结合EZH2并抑制其表达，抑制HL60细胞增殖，促进其凋亡，起到抑癌的作用，为miR-186有可能成为AML治疗的新思路提供了理论依据。