超声造影在三阴性乳腺癌动物模型中的实验研究

马金秋，姚得顺，王 洋

（唐山市人民医院：1.超声科；2.乳腺外科，唐山 063000）

乳腺癌是一种生物学特性非常异质的恶性肿瘤，根据组织学、免疫组织化学和分子生物学技术可将其分为不同的亚型。其中三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）约占所有类型乳腺癌的10%～17%，经常出现在年轻女性身上［1］。TNBC主要为基底型乳腺癌，具有侵袭性强、扩散转移风险大、临床预后差等特点。乳腺癌的治疗方法不尽相同，治疗效果的准确评价和疗效的早期预测是临床医生关注的焦点［2］。近年来，对比增强超声在疗效评价中的价值得到了广泛的研究，在动物模型和临床试验中表现出良好的早期疗效评价［3］。本研究旨在建立TNBC化疗模式小鼠MDA-MB-231-9，利用超声造影监测模型小鼠化疗过程，从而为早期准确评估和预测TNBC疗效提供影像学依据。

1 资料与方法

1.1 一般材料MDA-MB-231乳腺癌细胞株。健康Balb/c裸鼠（实验动物的许可证号码：SYXK（上海）2011-0113），SPF环境中饲养，鼠龄6～8周，体重16～21g。超声仪器 ：EsaoteMylab90（Esaote，Genoa，Italy）彩色超声诊断仪。东芝Aplio500彩色彩色多普勒超声诊断仪。声诺维（SonoVue，Bracco，Italy），USphereTMPrime（佳汇生物股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 三阴性乳腺癌化疗模型建模取制备的MDAMB-231细胞，将200μL细胞悬浮液（1×106细胞/每只裸鼠）皮下注射到每只裸鼠的右腋窝。当肿瘤肿块约为5×5mm时，随机分配给实验组和对照组，每组10～20只小鼠。实验组在联合用药的前1、3、5天给予，对照组给予生理盐水。未完成一周治疗的裸鼠最终被淘汰。

1.2.2 二维超声造影评估乳腺癌化疗疗效所有裸鼠化疗模型的评估期为7天。在第1、3、5天给药前（或正常盐水）和第7天给药前，进行对比增强超声评估。分为实验组A和对照组A，实验组B和对照组B。A组使用超声仪器EsaoteMylab90和超声显像造影剂，B组使用东芝Aplio500超声仪器和Prime造影剂。A组：使用超声波仪器的探头LA522EsaoteMylab90和机器的参数进行调整，以获得最佳的显示效果，肿瘤：机械指数（MI=0.09）一级，焦点是肿瘤上缘，该增益调整为只显示肿瘤边缘。然后，开始实时超声造影剂的成像模式，1毫升SonoVue造影剂通过尾静脉和迅速推注，同时开始启动计时器和存储功能，它们存储图像动态对比度在仪器中，时间为2～3分钟。对比分析软件采用QontraXt，生成时间强度曲线、峰值强度和峰值时间（TTP）。B组：采用东芝Aplio500超声仪器探头14L5，二维超声对比方式参数如下：机械指标（MI=0.08）。对造影剂抽吸1mlPrime，快速推注入尾静脉。使用东芝Aplio500机器的图像处理功能进行分析。得到峰值强度和TTP。分析两组上述参数的差异和治疗过程的变化。

1.2.3 病理检查及分析所有裸鼠均在第7天造影评估后处死，取瘤块，并行H&E染色、CD31及VEGF免疫组化染色。在H&E染色切片下观察细胞形态，CD31及VEGF染色结果以细胞膜或胞浆出现棕黄色产物为阳性结果。

1.3 统计方法应用SPSS 18.0软件对数据进行分析，以P＜0.05为存在显著性差异，组间比较采用t检验，实验组和对照组间△Peak值比较采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Pearson积矩相关系数，︱r︱=0～0.19提示极低相关性或者无相关性，0.20～0.39提示低相关性，0.40～0.59，提示中度相关性，0.60～0.79提示强相关性，＞0.80提示极强相关性。

2 结果

2.1 二维超声造影定量分析最终实验组A有16只裸鼠，对照组A有5只，实验组B有8只，对照组B有5只。与对照组相比，实验组A、B均发现Peak值呈下降趋势。第1、3、5天的Peak值在实验组与对照组间均无明显统计学差异，在第7天时，两组间有显著差异，见表2-1及图2-1、2-2。第3、5、7天的Peak值减去第1天的Peak值得到△PeakD3-D1、△PeakD5-D1与△PeakD7-D1值，实验组B与对照组B之间的△PeakD3-D1、△PeakD5-D1、△PeakD7-D1均有显著性差异，说明用B组方法观察到的实验组Peak值递减的幅度大于对照组Peak值递增的幅度，而实验组A与对照组A之间三者无明显差异，见表2-2。

与对照组相比，实验组A和B的峰值均呈现下降趋势，而对照组呈现上升趋势。第7天实验组与对照组有显著差异，见表2-1。将实验组和对照组之间的值进行比较，我们发现有显著差异的△PeakD3-D1、△PeakD5-D1与△PeakD7-D1值，说明用B组方法观察到的实验组Peak值递减的幅度大于对照组Peak值递增的幅度，而实验组A与对照组A之间三者无明显差异，见表2-2。

表2 -1 实验组与对照组间Peak值的对比及变化

表2 -2 实验组与对照组间△Peak值的比较与变化

实验组A的TTP值在前1、3、5、7天呈上升趋势，对照组A的TTP值呈下降趋势。然而，除第一天（P=.002）外，两组间TTP无显著差异，如表2-3所示。实验组B的TTP值在1、3、5处呈现上升趋势，在7处异常急剧下降。对照组B的TTP值没有明显的趋势变化。

表2 -3 实验组与对照组间TTP值的对比与变化

2.2 病理结果分析在H&E彩色切片下，可以看到大面积的乳腺癌细胞和血管，也可以看到一些坏死斑块。实验组和对照组的CD31和VEGF免疫组化分析结果如表2-4所示。与实验组相比，实验组CD31免疫组化信号的平均面积明显减小，方法B的累积光密度在实验组和对照组之间存在差异；此外，实验组免疫组化信号VEGF的平均表面积和累积光密度均有所下降（P＜0.05）。

表2 -4 实验组与对照组间免疫组化定量分析与比较

2.3 二维超声造影与免疫组化的相关性分析如表2-5所示，对第7天的峰值、△PeakD7-D1和免疫组化水平CD31和VEGF进行相关性分析，未发现显著相关性。第七天Peak值、△PeakD3-D1、△PeakD5-D1、△PeakD7-D1与免疫组化的相关性分析，可见Peak值与CD31（Area-p）、VEGF（Area-p）、VEGF（IOD）值均表现出极强相关性（r＞0.80，P＜0.05），△PeakD7-D1与CD31（Area-p）、VEGF（IOD）值间具有强相关性，与 CD31（IOD）、VEGF（Area-p）值间具有中等相关性。

3 讨论

1971年，Folkman和其他研究人员提出了“肿瘤生长和转移依赖于新血管形成”的概念，为肿瘤的治疗提供了新的思路。据此已经开发出抑制肿瘤血管生成的靶向抗肿瘤药物，如Beva单克隆抗体等。多项研究表明乳腺癌是一种高度异质性疾病，侵袭性强，预后差，组织病理学的复杂性，使得细胞形态学评估非常困难［4-5］。研究表明，乳腺癌治疗后肿瘤血流动力学的变化比形态学的变化要早得多。因此，肿瘤组织微血管功能的评估对于乳腺癌治疗的早期评估是很有价值的［6］。

表2 -5 二维超声造影与免疫组化分子表达的相关性分析

使用SonoVue造影剂的增强造影剂可以检测直径约为40μm的病变。因此，对比增强超声也被认为是一种检测血管生成变化的成像方法，对比增强超声相对增强CT，便宜、灵敏度低、安全，且可重复使用。造影剂在损伤区域的最大灌注时间与血流速度有关。微血管密度越高通常表明血液流动更快，这反过来又会使造影剂更快地进入损伤区域［7］。本研究实验发现，与对照组相比，第7天实验组的最大值明显较低，表明该最大值可以预测乳腺癌化疗的疗效。许多研究证实，新辅助治疗后，乳腺癌病变的灌注强度显著降低，表明最大灌注强度是化疗疗效的指标［8］。实验研究小组使用了乳腺癌细胞mcf来评估植入的有效性，通过对比后发现，超声造影第一次剂量后，实验组的最大强度明显降低，且二次剂量后，实验组的最大强度很小，相对温和，但在整个治疗周期后，实验组和对照组的最大强度存在显著差异。超声波造影剂是一种六氟化硫（SF6）微气泡，由磷脂和聚乙二醇包裹，平均直径2-3μm。它也是一种常用的临床造影剂。可以改善乳腺病变血管形成的影像学效果，使定性诊断更加准确［9］。

USphere超声微泡临床造影剂为单层膜微泡，以八氟丙烷气体（C3F8）为芯气，磷脂物质为外膜。磷脂层可以形成一层保护膜，有效减缓气体扩散，防止微气泡融合成更大的气泡，并在体内稳定循环，提高成像时间［10-11］。本文使用超声诊断仪器百胜Mylab90及造影剂SonoVue，并使用了东芝Aplio500及造影剂来完成定量分析。结果表明，只有二维对比超声定量参数的峰值具有提示意义，但在第7天峰值与最终的MVD和VEGF比较中，其表达水平有了高度相关，所以使用超声诊断仪器东芝Aplio500和造影剂改良的二维超声略优于对照组方法。

在此次实验中，我们发现对比增强超声不能检测早期肿瘤的血流动力学变化。与ct、mri和pet相比，对比增强超声只能显示肿瘤的一个切面，这很容易导致对整个肿瘤血管生成的评估出现错误。同时，本部分实验中对比增强超声参数与定量免疫组化分析的相关性不高，需要更灵敏的分子超声成像技术，才能在其他实验中专门针对VEGFR-2进行有效评估。目前，二维超声分子成像已被证明是非常有效的，在监测抗血管肿瘤治疗方面具有较高的有效性［12］。