香烟烟雾联合脂多糖对气道炎症及衰老的影响

于旭华，丁美祝，谢丹，胡佩欣，梁紫尧，范龙，林琳，许银姬

(广州中医药大学 第二附属医院 呼吸与危重症科，广东 广州 512120)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种危害健康的全球性疾病.临床上主要表现为慢性咳嗽，呼吸困难或气短、胸闷、喘息、消瘦及疲乏等症状.病理上则表现为持续的小气道慢性炎症，过度的氧化应激和金属蛋白酶表达升高，肺上皮细胞在长期炎症的刺激下逐渐衰老损伤，并形成气道狭窄[1].目前，COPD发生的病理机制并不完全清楚.吸烟和反复的气道感染是COPD形成的主要因素.COPD动物模型的制备主要以香烟暴露或联合气道刺激物的滴注为主要手段，然而，尽管COPD以慢性气道炎症为主要表现，但在大多数动物模型中仍表现为炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达升高的急性肺部炎症[2].

为了进一步揭示COPD慢性或亚急性气道炎症发生的病理表现和特点，本研究利用较长时间香烟暴露(7周)，联合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)气道反复滴注以及体外实验，观察和比较香烟、LPS以及二者联合刺激对小鼠气道免疫细胞、氧化应激、炎症因子表达以及气道上皮衰老损伤的作用.从而反映和揭示吸烟联合反复气道感染对气道免疫、炎症及组织衰老的影响.

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

脂多糖(批号：113M4068V)与2-丁酸佛波醇酯(PDB，批号：P1269-10MG)均购自Sigma公司.NucleoZOL(Macherey-Nagel,lot：1609/001)，异丙醇购自广州化学试剂有限公司.SYBR Premix Ex TapTMⅡ(No.RR820)试剂盒与Prime-ScriptTMRT Master Mix(No.RR036A-1)试剂盒购自TaKaRa公司.Senescence β-Galactosidase Staining Kit (#9860)购自CST公司.大前门牌过滤嘴香烟(烟碱含量0.8 mg，焦油量11 mg /支)购自上海烟草集团有限公司.主要仪器:多功能台式冷冻离心机(Allegra X22R), PCR扩增仪(Applied Biosystem)，荧光定量PCR仪(VI A7)及显微镜(BX61+DP720,Olympus).

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及培养

实验动物选用C57雄性小鼠(合格证号：11400700313310，购于北京维通利华实验动物技术有限公司)，小鼠随机分为4组，分别为假熏烟联合假手术组，熏烟联合假手术组，假熏烟联合LPS组，熏烟联合LPS组，每组8只.

熏烟方法：参考Gualano等[3]的熏烟方法.将小鼠置于18 L塑料熏烟箱中进行熏烟.每次3支香烟，2次/d，烟雾用60 mL 注射器注入熏烟箱中.于每天早上9点与下午3点分别进行，每次1 h，每周5 d，连续7周后取材.假熏烟组小鼠每日同一时间放入同样大小塑料箱中，但不给予香烟暴露.

LPS滴注方法：于熏烟第28、42天熏烟前1 h，经质量分数4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，切开气管处皮毛，向气管内以微量注射器滴入10 μg LPS/30 μL PBS，完成滴注后倾斜上提小鼠躯体，轻揉按摩肺部，使LPS尽可能均匀地分布到两肺组织中，再缝合颈部皮肤，待小鼠清醒后再次置于笼内正常饲养.假手术组小鼠，给予同一时间气道滴注30 μL PBS，其余与LPS组小鼠处理相同.

1.2.2 标本采集与处理

实验第47天，采用戊巴比妥钠致小鼠安乐死，切开皮毛充分暴露气管，向肺内分4次注入1.2 mL PBS，回收支气管肺泡灌洗液约1 mL，用于细胞计数，分类计数及过氧化物检测.肺组织经液氮快速冷冻，-80 ℃低温环境保存.

1.2.3 体质量记录

每天熏烟或滴注LPS前称小鼠体质量，体质量记录时间点为第0天，每周三和周日，以及滴注LPS前及之后连续3 d.

1.2.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数及分类计数

将BALF静置1 h，以3 000 r/min离心10 min后去上清液，加入500 μL的红细胞裂解液，混匀静置2 min 后以2 500 r /min离心5 min.弃上清液混匀取20 μL用Countstar自动细胞计数仪进行细胞计数.其他的混悬液均匀涂于载玻片上，经固定、H&E染色后进行分类计数，计算巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等各类细胞所占的百分比.

1.2.5 气道灌洗液细胞氧化应激测定

检测方法参照课题组之前的研究方法[4].进行2-丁酸佛波醇酯诱导的细胞氧化应激测定，选用不透光96孔板，每孔加入50 μL细胞混悬液进行化学发光测定，每孔测定1 s，进行30个循环.过氧化物含量=(测定值-空白值)/50 μL 细胞数×1 000.

1.2.6 RT-qPCR法检测肺组织细胞因子

提取肺组织总RNA后反转录合成cDNA，按TaKaRa扩增试剂盒说明书严格按照流程操作，检测各组肺组织中细胞因子，所有实验重复3次，结果以β-actin为内参，按照2-ΔΔCt法计算RNA的相对表达量.

1.2.7 Western blot检测蛋白表达水平

使用微型凝胶装置(BioRad)在质量分数15%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离20 μg样品，然后将蛋白质转移到PVDF膜上.在稀释比例为1∶1 000的Ⅰ抗4 ℃环境下孵育过夜，常温下孵育相应的HRP标记的Ⅱ抗1 h，Ⅱ抗稀释比例为1∶1 000，以β-actin为内参照，用BioRad显影仪进行暗室中显影，每组实验重复3次.最后用Image lab软件分析目的蛋白相对灰度值.

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer Sequence of RT-qPCR

1.2.8 香烟提取物的制备和细胞培养

将大前门香烟连接装有25 mL DMEM培养基的制备装置中，以3 mL/s的速度吸烟，并使烟雾通过培养基.吸烟10 s后，休息20 s，然后进行下一次吸烟，直至吸完1支香烟[5].用0.22 μm过滤器灭菌，并确定最终溶液质量分数为100%.最后，将香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)溶液稀释至质量分数1%.

将A549细胞种入24孔板，于每天8，14，20点分别给予质量浓度10 μg/mL LPS或 PBS刺激1 h，之后用质量分数1%CSE或DMEM培养基培养细胞，共48 h.

1.2.9 β-gal 染色实验

根据β-gal 染色试剂盒说明书，先用固定液固定细胞，经PBS冲洗后，将配置的含有X-gal底物的stain buffer加入24孔板内，避光37 ℃孵育12 h.在光学显微镜下，计数阳性细胞个数及比例.

1.3 统计学方法

本实验数据用GraphPad Prism 8.0软件分析，所有计量资料用均数±标准差表示，多组比较采用One-way ANOVA 方法，用LSD进行两两检验，以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 香烟烟雾及LPS气道滴注对小鼠体质量的影响

体质量减轻情况如图1.假熏烟小鼠气道滴注生理盐水后，体质量未见明显下降.与假熏烟联合假手术小鼠相比，假熏烟联合LPS气道滴注小鼠在第30天，体质量轻度下降1.8%(P>0.05)，在第44天，体质量下降更加明显6.08%(P<0.05).与假熏烟小鼠比较，熏烟小鼠体质量明显下降平均5.54%(P<0.05).与熏烟联合假手术组小鼠比较，熏烟联合LPS气道滴注小鼠在第28和42天后，体质量未发生明显变化(P>0.05).

1)与假熏烟+假手术组比较，P<0.051)Compared with sham+vehicle mice，P<0.05图1 香烟暴露7周及LPS气道滴注对小鼠体质量的影响Fig.1 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on body weight of mice

2.2 香烟暴露7周及LPS气道滴注对小鼠BALF细胞数量的影响

BALF细胞数量如图2.与假熏烟联合假手术组小鼠相比，假熏烟联合LPS组小鼠BALF细胞总数与巨噬细胞计数明显增加(P<0.01), 中性粒细胞数与淋巴细胞有增多的趋势，但无统计意义(P>0.05); 熏烟联合LPS气道滴注小鼠BALF细胞总数与巨噬细胞数明显增多(P<0.05)，中性粒细胞数与淋巴细胞有增多的趋势，但无统计意义(P>0.05).与熏烟联合假手术组小鼠相比，假熏烟联合LPS组BALF细胞总数和巨噬细胞计数增多，差异具有统计学意义(P<0.01)，中性粒细胞数与淋巴细胞有增多的趋势，但无统计意义(P>0.05)；熏烟联合LPS组BALF细胞总数明显增加(P<0.05)，中性粒细胞数与淋巴细胞有增多的趋势，但无统计意义(P>0.05).

2.3 香烟暴露7周及LPS气道滴注对小鼠肺组织细胞活性氧产生的影响

与假手术联合假熏烟组小鼠对比，假熏烟联合LPS组小鼠及熏烟联合LPS小鼠气道灌洗液细胞过氧化物的产生均明显增多(P<0.01).与熏烟组小鼠相比，假手术联合LPS组与熏烟联合LPS组小鼠过氧化物产出率明显增加(P<0.05).与假熏烟联合LPS组小鼠相比，熏烟联合LPS组小鼠气道过氧化物产出速率轻度下降，无统计差异(P>0.05)(图3).

2.4 香烟暴露7周及LPS气道滴注对小鼠肺组织细胞因子及金属蛋白酶mRNA表达影响

与假熏烟联合假手术组相比，假熏烟联合LPS组的小鼠肺脏组织IL-6 mRNA表达量明显上升(P<0.05)，熏烟联合LPS组小鼠肺组织MMP12表达明显升高(P<0.05)；与熏烟联合假手术组相比，假熏烟联合LPS组的小鼠肺脏组织IL-6表达量也明显上升(P<0.01)，熏烟联合LPS组小鼠肺组织MMP12表达明显升高(P<0.01)；与假熏烟联合LPS组小鼠相比，熏烟联合LPS组小鼠肺组织中IL-6表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05).MMP12表达量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)(图4).

1)与假熏烟+假手术组比较，P<0.05；2)与假熏烟+假手术组比较，P<0.01；3)与熏烟+假手术组比较，P<0.05；4)与熏烟+假手术组比较，P<0.01. A：灌洗液细胞总数，B：巨噬细胞总数，C：中性粒细胞总数，D：淋巴细胞总数.1)Compared with sham+vehicle group, P<0.05; 2) Compared with sham+vehicle group, P<0.01; 3) Compared with CS +vehicle group, P<0.05; 4) Compared with CS +vehicle group, P<0.01. A：Total number of the cells, B：Macrophages, C：Neutrophils, D： Lymphocytes.图2 香烟暴露7周及LPS气道滴注对小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数及计数的影响Fig.2 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on number of BALF cells

1)与假熏烟+假手术组比较，P<0.05；2)与假熏烟+假手术组比较，P<0.01；3)与熏烟+假手术组比较，P<0.05.

2.5 香烟暴露7周及LPS气道滴注对小鼠肺组织P16、P21表达的影响

与假熏烟联合假手术组比较，熏烟联合LPS组的小鼠肺脏组织P16和P21表达量均升高，其中，P16升高3.32倍(P>0.05), P21升高4.35倍(P<0.05).熏烟联合假手术组和假熏烟联合LPS组小鼠肺组织P16和P21表达轻度升高，但无统计意义(P>0.05)(图5).

2.6 香烟提取物及LPS对气道上皮β-半乳糖苷酶活性的影响

与空白组比较，CSE+LPS组β-gal染色阳性细胞数量明显高于空白组(P<0.01)，CSE处理组(P<0.01)和 LPS处理组(P<0.05)(图6).

1)与假熏烟+假手术组比较，P<0.05；2)与熏烟+假手术组比较，P<0.01；3)与假熏烟+LPS组比较，P<0.05. A：全肺组织中 IL-6的mRNA表达，B：全肺组织中 TNF-α 的mRNA表达，C：全肺组织中 IL-1β的mRNA表达，D：全肺组织中 MMP12的mRNA表达.1)Compared with sham+vehicle group, P<0.05; 2) Compared with CS +vehicle group, P<0.01; 3) Compared with sham+ LPS group, P<0.05. A：Expression of IL-6 mRNA in whole lung cytokines，B：Expression of TNFa mRNA in whole lung cytokines，C：Expression of IL-1beta mRNA in whole lung cytokines，D：Expression of MMP12 mRNA in whole lung cytokines图4 香烟暴露7周及LPS气道滴注对小鼠肺组织细胞因子及金属蛋白酶MMP12表达的影响Fig.4 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on cytokines and MMP12 expression in lung tissues

1)与假熏烟+假手术组比较，P<0.05. A：P21,P16 条带示意图, B：P16蛋白相对表达量，C：P21蛋白相对表达量.1)Compared with sham+vehicle group, P<0.05. A：Representative bands of P16 and P21, B： Relative protein expression of P16, C：Relative protein expression of P21.图5 香烟暴露7周及LPS气道滴注对小鼠肺组织P16和P21蛋白表达的影响Fig.5 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on p-16 and p-21 expression in lung tissues

1)与空白组比较，P<0.01； 2)与CSE组比较，P<0.01；3)与LPS组比较，P<0.05

3 讨论

吸烟合并感染是COPD的常见原因.香烟烟雾中含有多种有害物质，目前被公认为是许多肺部炎症性疾病发生和发展的重要危险因素[6-7].LPS是革兰氏阴性细菌的一种成分，可以刺激巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞等合成释放一系列促炎因子，诱导炎症的发生.因此香烟烟雾刺激联合LPS气道滴注常作为诱导慢阻肺急性加重的动物模型的重要手段[8-9].然而慢性阻塞性肺病表现为慢性肺部炎症伴有全身消瘦、系统性慢性炎症等特征，并常伴有反复感染.为了揭示熏烟和反复感染对肺部慢性炎症状态及组织修复状态的影响，本研究运用7周香烟熏烟暴露联合两次LPS气道滴注模拟吸烟联合反复感染的状态，并在LPS滴注1周后，观察小鼠体质量、气道炎症及组织衰老的病理表现.

在急性感染的过程中，体质量下降往往代表了系统炎症的发生，熏烟导致小鼠体重下降.其原因为：一是烟雾对气道的长期刺激导致气道炎症的发生，从而促进了小鼠的新陈代谢，增加能量消耗导致体重下降; 二是尼古丁通过刺激神经受体、影响激素分泌和脂肪代谢，抑制食欲等减轻体重[9].非熏烟小鼠在第28天气道滴注LPS后，体重在第29、30天轻度下降，可能与炎症刺激后食欲抑制有关；在第42天，小鼠再次滴注LPS后，第43、44天体重下降较明显，说明肺部二次受到刺激后，小鼠全身炎症更加明显.熏烟小鼠在第28和42天，气道滴注LPS后，与熏烟但未接受LPS气道滴注小鼠相比，体重变化无明显差异.这可能与尼古丁本身具有食欲抑制作用有关[11]，也表明香烟暴露可能具有缓解气道炎症的作用.

持续的气道炎症细胞浸润是COPD的重要特征.相比于假熏烟联合假手术组，假熏烟联合LPS组BALF细胞总数、巨噬细胞数明显增多，而中性粒细胞数量轻度升高，说明LPS气道滴注1周后，进入以巨噬细胞逐渐增多为主的亚急性炎症或慢性炎症阶段.与假熏烟联合假手术组比较，熏烟联合LPS气道滴注组BALF中白细胞总数和巨噬细胞总数明显增多，中性粒细胞轻度升高，但细胞总数和巨噬细胞数目略低于假熏烟联合LPS气道滴注组小鼠，说明香烟对气道炎症细胞的浸润有一定抑制作用, 其机制可能与香烟抑制AP-1的激活有关[12].

有研究表明，LPS与香烟烟雾共同诱导的BALF中总白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞数量都会显著增加[13].这与本研究结果矛盾，其原因可能与香烟作用时间和剂量有关.

过度的氧化应激和促炎因子及金属蛋白酶的表达是COPD的另一特征.细胞过氧化物的大量产生是细胞发挥免疫作用、杀灭微生物的重要途径.本实验中假熏烟联合LPS滴注组与熏烟联合LPS滴注组BALF的过氧化物产出率明显高于假熏烟联合假手术组以及熏烟联合假手术组，表明在LPS的诱导下，气道免疫细胞处于应激状态，有利于吞噬细胞对外源病原体的清除，而熏烟联合LPS气道滴注组BALF过氧化物水平较假熏烟联合LPS气道滴注组小鼠稍低，说明熏烟可能导致气道免疫细胞的功能障碍[14].

IL-6，TNF-α，IL-1β是气道急性炎症反应的标志分子.而IL-6是最早升高的炎症标记物.当感染或组织损伤发生时，IL-6由单核细胞和巨噬细胞迅速产生，并通过激活免疫急性反应，有助于清除感染源和修复受损组织[15].本研究表明，与假熏烟联合假手术组相比，假熏烟联合LPS滴注组小鼠肺组织IL-6 mRNA表达明显升高，TNF-α、IL-1β mRNA表达无明显改变，说明假熏烟联合LPS滴注组小鼠肺组织处于急性或亚急性炎症阶段，而熏烟联合LPS气道滴注组小鼠肺部IL-6无明显升高，IL-1β轻度升高(P>0.05)，说明熏烟联合LPS气道滴注可能比单纯LPS气道滴注小鼠更早进入慢性炎症阶段.也有研究表明，在烟雾刺激基础上加以LPS的刺激会导致浆细胞样树突状细胞数量降低，其分泌细胞因子与肿瘤坏死因子TNF-α、IL-6和Toll 样受体(toll-like receptors，TLR)等促炎因子的水平均降低[16].MMP12由巨噬细胞产生，是促进弹性蛋白降解的一种金属蛋白酶.MMP12的超表达将导致细胞外基质的破坏，并存在于各种炎症反应[17].MMP12的过表达会导致病理性细胞外基质降解和过度的气道重塑，促进一些急性和慢性肺部疾病的宿主免疫炎症反应并参与肺气肿的形成[18-20].与假熏烟联合LPS滴注组相比，熏烟联合LPS滴注组的MMP12表达量明显上升，表明熏烟可能会加重LPS诱导的气道重塑.

肺上皮的功能衰退是COPD的另一特征，其机制可能与细胞衰老有关.细胞中β-半乳糖苷酶活性明显升高，可作为细胞衰老的标志物，而P21以及P16是细胞周期相关蛋白，它们的表达水平与细胞衰老的反映相关[21].Yue等[22]研究表明，LPS可以促进肺上皮细胞衰老，增加β-gal活性，其作用依赖于蛋白P53.P16和P21是P53基因下游最重要的基因之一，它的表达增加多是由于响应各种细胞内和细胞外刺激，以阻止细胞周期，确保基因的稳定性[23].Cottage等[25]研究表明，在CS诱导的肺上皮衰老模型中，MMP12显著上调[24].P16的敲除可以减少香烟烟雾诱导的肺组织MMP12及细胞因子的表达，减少肺组织的衰老和肺气肿的形成.

本实验表明香烟提取物联合LPS的反复刺激，明显增加A549细胞中β-半乳糖苷酶活性，并且其活性明显高于单纯LPS或香烟提取物刺激，说明香烟烟雾联合LPS的反复刺激明显促进了上皮细胞的衰老.与此同时，各组小鼠肺组中P16和P21的表达趋势与细胞实验一致.这进一步证实了香烟烟雾联合LPS反复刺激可加剧气道上皮的衰老，并提示可能与P53信号通路相关.

综上所述，香烟烟雾联合LPS反复刺激可诱导气道炎症和氧化应激，且其程度低于单纯LPS反复刺激，符合慢性/亚急性炎症改变；但香烟烟雾联合LPS反复刺激明显加剧了气道上皮细胞衰老，且衰老标志物明显高于单纯LPS反复刺激组.因此，香烟烟雾促进LPS诱导的上皮细胞衰老，并不依赖于炎症的加剧，可能与P53信号通路相关，且有待进一步研究.本研究揭示了7周香烟暴露联合LPS反复滴注诱导的肺部慢性/亚急性炎症动物模型中气道上皮明显衰老的病理表现，对于揭示COPD发生病理机制具有重要意义.