耐三代头孢菌素沙门菌的耐药基因分析*

黄晓黎，陈晓，王若南，陈瑜

(1.浙江大学医学院附属第一医院检验科，杭州 310003；2.浙江中医药大学附属第一医院检验科，杭州 310006;3.浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室，杭州 310003)

沙门菌是人类食源性疾病有关的主要病原体之一，可分为伤寒沙门菌和非伤寒沙门菌。轻度的沙门菌感染通常不需要抗菌药物治疗，但在幼儿、老年人和免疫功能低下者，沙门菌感染会引起伤寒、副伤寒、败血症等疾病，通常使用三代头孢菌素或氟喹诺酮类抗菌药物治疗[1-2]。2017年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)发布的关于全球十二大耐药性细菌排名，耐药性沙门菌位列第八，属于高度耐药。携带β-内酰胺酶类耐药基因而导致对三代头孢菌素耐药的沙门菌，更是给临床治疗和疾病防控带来巨大挑战。头孢噻肟(CTX)作为第一个用于临床的三代头孢注射剂，和头孢他啶(CAZ)一样，治疗时均不易引起双硫仑反应[3]，应用范围广，其耐药性的变化更值得关注。本研究用CTX和CAZ筛选本地区临床分离的沙门菌，筛查超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase, ESBLs)和7种β-内酰胺类耐药基因，了解本地区耐三代头孢菌素沙门菌的耐药基因分布，为疾病的防控和治疗提供真实可靠的依据。

1 材料与方法

1.1菌株收集及筛选 收集浙江省5家医院(浙江大学医学院附属第一医院、杭州市儿童医院、三门县人民医院、嘉兴市第一医院、嘉兴市第二医院)2016年1月至2018年12月分离的沙门菌，采用Vitek 2 Compact微生物鉴定仪进行细菌鉴定，MALDI-TOF Bruker Bio Typer进行鉴定确认。收集的沙门菌采用纸片扩散法(K-B法)进行常规药物敏感试验，包括：氨苄西林(AMP)、哌拉西林-他唑巴坦(TZP)、头孢西丁(FOX)、头孢唑啉(KZ)、头孢呋辛(CXM)、CAZ、CTX、环丙沙星(CIP)、复方磺胺甲噁唑(SXT)、美罗培南(MEM)。药敏结果判读以美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)为参考标准[4]。选取对CTX和(或)CAZ耐药的157株沙门菌，其中CTX耐药、CAZ敏感或中介23株，CAZ耐药、CTX敏感或中介54株，CTX和CAZ均耐药80株。

1.2主要仪器及试剂 Vitek 2 Compact微生物鉴定仪及配套鉴定卡(法国生物梅里埃公司)，MALDI-TOF Bruker Bio Typer系统(德国Bruker公司)，DNA Engine PCR扩增仪、Mini-Protean 3水平电泳仪、Gel Doc XR+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；AMP、TZP、FOX、KZ、CXM、CAZ、CTX、CIP、SXT、MEM、头孢噻肟/棒酸(CTC)、头孢他啶/棒酸(CAC)药敏纸片(英国Oxoid公司)，沙门菌诊断血清(60种)(宁波天润生物药业公司)，Taq DNA 聚合酶、100 bp DNA marker (TaKaRa公司)。

1.3血清学分型 通过使用Kauffman-White(K-W)血清学分型方法，采用玻片凝集试验，对沙门菌进行血清学分型。

1.4ESBLs确证试验 用无菌棉拭子蘸取0.5麦氏浊度单位的菌悬液，均匀涂布于M-H琼脂平板。用药敏纸片分配器将CTX、CAZ、CTC、CAC纸片贴于M-H琼脂平板上，放置37 ℃恒温培养箱中培养16～18 h。参照CLSI 2019大肠埃希菌ESBLs的确认标准，2组药物中任何一组加棒酸后纸片的抑菌圈直径比对应的无棒酸药物纸片的直径≥5 mm，即判定为产ESBLs菌株[4]。

1.5耐药基因检测 用热裂解法提取核酸，用PCR技术检测沙门菌的7种β-内酰胺类耐药基因。参照文献[5-8]合成引物，见表1，引物合成由上海生工生物公司完成。PCR反应体系25 μL，包括2×Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反应参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(退火温度见表1)，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 5 min。取5 μL扩增产物，经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照后分析结果。随机选取1～3株各耐药基因PCR阳性产物送上海生工生物公司进行正反序列测定，测序结果经美国国家生物技术信息中心/局部序列比对基本检索工具(NCBI/BLAST)比对确认。

1.6统计学分析 用SPSS 21.0软件进行。计数资料以百分率(%)表示，两组之间比较采用χ2检验、连续性校正χ2检验或Fisher检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 沙门菌耐药基因PCR检测相关引物

2 结果

2.1沙门菌对常规药物的耐药情况 157株对CAZ和(或)CTX耐药的沙门菌对AMP的耐药率最高，达89.17%，其次为CAZ和CTX，分别为85.35%和65.61%，对TZP耐药率较低，未发现对MEM耐药菌株，见表2。

表2 沙门菌对常规药物的耐药率

2.2血清型分布 157株沙门菌分为20种不同的血清型，分别是鼠伤寒沙门菌94株、肠炎沙门菌26株、婴儿沙门菌6株、纽波特沙门菌5株、伦敦沙门菌3株、斯坦利沙门菌3株、汤卜逊沙门菌3株、肠沙门菌副伤寒B血清型3株、德比沙门菌2株、阿贡那沙门菌2株、肠沙门菌副伤寒C血清型1株、病牛沙门菌1株、都柏林沙门菌1株、黄金海岸沙门菌1株、康科特沙门菌1株、里森沙门菌1株、蒙得维的亚沙门菌1株、明斯特沙门菌1株、肠沙门菌伤寒血清型1株、塔克松尼沙门菌1株。其中，鼠伤寒沙门菌最多(59.87%，94/157)，肠炎沙门菌次之(16.56%，26/157)。

2.3耐药基因分布 127株检出耐药基因，检出率为80.89%(127/157)。7种耐药基因中，检出率由高到低依次是blaTEM(65.61%，103/157)、blaCTX-M(50.32%，79/157)、blaOXA-10(5.73%，9/157)、blaSHV(0.64%，1/157)，未检出blaPER、blaCMY和blaACC。blaCTX-M分组基因中，以blaCTX-M-1G(n=46)和blaCTX-M-9G(n=33)多见，未检出blaCTX-M-2G、blaCTX-M-8G和blaCTX-M-25G。

2.4鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的耐药基因携带率比较 鼠伤寒沙门菌51株检出blaCTX-M，其中blaCTX-M-1G携带率为27.66%(26/94)，blaCTX-M-9G携带率为26.60%(25/94)；肠炎沙门菌14株检出blaCTX-M，均属于blaCTX-M-1G，携带率为53.84%(14/26)。鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G携带率差异有统计学意义(χ2=6.285，P=0.012；χ2=8.735，P=0.003)。

2.5ESBLs确证试验结果 157株沙门菌，80株产ESBLs，阳性率为50.96%。其中，鼠伤寒沙门菌ESBLs阳性率为54.26%(51/94)，肠炎沙门菌ESBLs阳性率为53.85%(14/26)。6株婴儿沙门菌中，3株产ESBLs，3株不产ESBLs。80株ESBLs阳性沙门菌中，CTX耐药、CAZ敏感或中介组20株，CTX和CAZ均耐药组60株。77株ESBLs阴性沙门菌中，CTX耐药、CAZ敏感或中介组3株，CAZ耐药、CTX敏感或中介组54株，CTX和CAZ均耐药组20株。

2.6ESBLs阳性和ESBLs阴性沙门菌耐药基因分布特点 80株ESBLs阳性沙门菌中，28.75%检出1种耐药基因，主要为blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G；62.50%检出2种耐药基因，常见模式是blaCTX-M-1G+blaTEM(n=35)和blaCTX-M-9G+blaTEM(n=14)；8.75%检出3种耐药基因，以blaCTX-M-1G+blaTEM+blaOXA-10多见。77株ESBLs阴性沙门菌中，59.74%检出1种耐药基因，均为blaTEM；1株检出2种耐药基因；38.96%未检出耐药基因。ESBLs阳性菌株blaCTX-M和blaOXA-10的检出率显著高于ESBLs阴性菌株(P<0.05)，而两组间blaTEM检出率差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 ESBLs阳性和ESBLs阴性沙门菌耐药基因分布

2.7沙门菌表型与耐药基因分布 根据表型分为3组：CAZ耐药、CTX敏感或中介组(n=54)，CTX耐药、CAZ敏感或中介组(n=23)及CAZ和CTX均耐药组(n=80)。CAZ耐药、CTX敏感或中介组只携带一种耐药基因blaTEM，携带率22.93%(36/157)；CTX耐药、CAZ敏感或中介组的沙门菌携带的耐药基因模式以blaCTX-M-9G(n=8)和blaCTX-M-9G+blaTEM(n=7)多见；CAZ和CTX均耐药组的沙门菌携带的耐药基因模式以blaCTX-M-1G+blaTEM(n=35)最多。103株对CTX耐药的沙门菌中，76.70%检出blaCTX-M；54株对CTX不耐药的沙门菌中，未检出blaCTX-M，2组间差异有统计学意义(χ2=83.366，P=0.000)。134株对CAZ耐药的沙门菌中，66.42%检出blaTEM；23株对CAZ不耐药的沙门菌中，60.87%检出blaTEM，2组间差异无统计学意义(χ2=0.268，P=0.384)。blaTEM在3组中的携带率分别为66.67%、60.86%及66.25%，差异无统计学意义(χ2=0.270，P=0.874)。

3 讨论

沙门菌是全球常见的食源性肠道致病菌之一，其耐药性与长期使用抗菌药物有关。沙门菌的耐药性与其所携带的耐药基因密不可分。根据2019年中国细菌耐药监测网(CHINET)结果显示，鼠伤寒沙门菌(n=636)和肠炎沙门菌(n=454)对CAZ的耐药率分别为21.3%和11.5%[9]。沙门菌对β-内酰胺类药物耐药的一个很重要的因素是产生β-内酰胺酶，尤其是ESBLs，常见的型别是blaTEM、blaCTX-M、blaOXA和blaSHV。本研究沙门菌blaTEM检出率为65.61%，高于浙江余姚地区罗学辉等[10]报道的44.07%；blaCTX-M检出率50.32%，高于罗学辉等[10]报道的27.12%、北京地区曲梅等[11]报道的7.38%；blaOXA检出率为5.73%，明显低于曲梅等[11]报道的12.30%。相较于罗学辉等[10]研究的沙门菌没有经过药物的筛选和曲梅等[11]筛选用的药物是青霉素类，本研究选取的是耐三代头孢菌素的沙门菌，相关耐药基因的检出率可能会有所差异。耐CTX沙门菌blaCTX-M检出率为76.70%，低于广东地区姜琪等[12]报道的88.4%；blaSHV检出率为0.97%，未检出blaCMY，这和姜琪等[12]报道的未检出blaSHV和blaCMY检出率为21.4%亦有所不同，可能是2项研究分离的沙门菌存在地域和年份的差异，而且姜琪等[12]研究的是鼠伤寒沙门菌，这和本研究的沙门菌分布20种血清型也有差异。

本研究检出blaOXA-10的沙门菌都表现出对CTX耐药，和Jeon等[13]报道的blaOXA-10能够降低沙门菌对CTX敏感性的观点相似。80株ESBLs阳性沙门菌98.75%检出blaCTX，邱玉锋等[14]研究中10株ESBLs阳性沙门菌都检出blaCTX，表明ESBLs阳性沙门菌的耐药性主要由blaCTX介导。blaCTX耐药基因可以通过水平传播和垂直克隆扩增2种方式，使得blaCTX可以在不同细菌之间以及亲代和子代之间广泛传播。77株ESBLs阴性沙门菌61.04%检出blaTEM，和岳美娜等[15]关于blaTEM耐药基因可能与ESBLs阴性沙门菌耐药性相关的观点相似。可能是blaTEM中blaTEM-1和blaTEM-2没有超广谱酶特征，对103株检出blaTEM的沙门菌测序比对，是后续研究的一个方面。33.33%对CAZ耐药和15%对CAZ和CTX均耐药的沙门菌未检出β-内酰胺类耐药基因，低于Yang等[16]的55%，这些对三代头孢菌素耐药的沙门菌其耐药性可能由其他机制介导，例如外膜蛋白(OmpC和OmpF)的缺失和外排泵AcrAB-TolC的过表达[16]等。携带blaCTX-M的沙门菌均对CTX耐药，类似于Park等[17]在韩国的研究结果，表明CTX耐药和携带blaCTX-M耐药基因之间有很高的符合度。然而，本研究中blaTEM耐药基因的分布在CAZ耐药和不耐药的沙门菌中差异未见统计学意义，这些CAZ耐药的菌株可能也由其他耐药基因参与介导。

随着头孢菌素类药物的大量使用，ESBLs和头孢菌素酶(AmpC酶)已成为沙门菌对β-内酰胺类药物耐药的2种主要灭活酶。由于β-内酰胺酶类相关耐药基因种类繁多，本研究仅选取其中研究较多的5种ESBLs基因和2种AmpC酶基因，难免造成表型耐药沙门菌相关基因型的漏检。沙门菌耐药机制非常复杂，可能由于某些耐药基因的高表达，或耐药基因所在位置、遗传结构和几种耐药基因的协同作用以及其他耐药机制共存等因素，表型和耐药基因型并非遵循严格的对应关系。近年来，高通量测序已经成为一种经济快捷的研究手段，特别是在细菌研究方面应用得越来越广泛。后续研究希望能对这些沙门菌进行全基因组测序，不仅对耐药基因有更详细的研究，而且能对毒力系统和代谢系统进行更全面的研究。