国产隐球菌荚膜多糖胶体金法检测试剂盒性能评价

陈东科，张洁，董家丽

(1. 北京医院检验科 国家老年医学中心 中国医学科学院老年医学研究院，北京100730；2.沂南县人民医院检验科，山东沂南061001;3.沧州市人民医院医学检验中心，河北沧州276300)

隐球菌病是由新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)感染引起的一种亚急性或慢性真菌病，主要有隐球菌性脑膜炎(cryptococcal meningitis, CM)和肺隐球菌病(pulmonary cryptococcosis, PC)。CM缺少易与其他病原感染相区分的临床症状，诊断困难。PC近年来发病率逐年增长，是仅次于念珠菌、曲霉菌的第三大类肺真菌病，在免疫功能正常和低下者中均可发生，其临床表现及影像学均缺乏特异性，易导致误诊和漏诊[1]。目前，实验室检测方法主要有涂片染色法、培养鉴定法、组织病理检查等，但是镜检结果判断主观性较大且检出率较低，培养方法的周期长，组织病理活检有创伤。隐球菌荚膜多糖抗原检测简便易操作，其敏感性和特异性均被业内认可。隐球菌荚膜多糖抗原检测试剂主要有乳胶凝集试验、酶联免疫分析法和侧流免疫层析法等。侧流免疫层析法有更高的敏感性、特异性及快速检测等优点，对隐球菌病的诊断有重要的临床意义[2-3]。本研究用已知菌株对国产和进口的两家隐球菌荚膜多糖抗原快检试剂验证其性能，旨在为临床诊治隐球菌病推荐更好的方法和检测试剂。

1 材料与方法

1.1菌株来源 选用真菌共28属100株菌，细菌2属2种。菌株为临床分离菌株和标准菌株，分离菌株均采用质谱和ITS测序双鉴定进行确认。(1)隐球菌属9种31株，其中包括18株新型隐球菌[包括15株新型隐球菌和3株新型隐球菌格鲁比变种(C.neoformansvar.grubii)]，3株格特隐球菌(C.gattii)，1株土生隐球菌(C.humicola)，1株浅白隐球菌(C.albidus)，1株罗伦特隐球菌(C.laurentii)，1株乌兹别克斯坦隐球菌(C.uzbekistanensis)，4株维多利亚隐球菌(C.victoriae)，1株C.dimennae，1株大隐球菌(C.magnum)；(2)毛孢子菌属(Trichosporon)16株，其中包括2株阿萨希毛孢子菌(T.asahii)，1株黏液毛孢子菌(T.mucoides)，3株耶氏毛孢子菌(T.jirovecii)，1株真皮毛孢子菌(T.dermatis)，1株蒙得维地亚毛孢子菌(T.montevideense)，1株辜氏毛孢子菌(T.guehoae)，1株皮瘤毛孢子菌(T.inkin)，3株圆形毛孢子菌(T.montevideense)，2株多哈毛孢子菌(T.dohaense)，1株毛孢子菌(T.coremiiforme)；(3)念珠菌属(Candida)11株，其中包括3株白念珠菌(C.albicans)，1株近平滑念珠菌(C.parapsilosis)，1株克柔念珠菌(C.krusei)，1株皱落念珠菌(C.rugosa)，1株葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)，1株耳念珠菌(C.auris)，1株都柏林念珠菌(C.dubliniensis)，1株希木龙念珠菌(C.haemulonis)，1株季也蒙念珠菌(C.guilliermondii)；(4)酵母菌24株，其中包括2株酿酒酵母(S.cerevisiae)，1株汉纳酵母(H.zeae)，1株小红酵母(R.minuta)，3株头状大孢酵母(M.capitatus)，4株胶红酵母(R.mucilaginosa)，1株丛梗孢酵母(M.pollinis)，1株马克思克鲁维酵母(K.marxianus)，1株粉状毕赤酵母(M.faoinosa)，1株库德里阿兹威毕赤酵母(P.kudriavzevii)，2株异常威克汉姆酵母(W.anomalus)，1株长孢罗德酵母菌(L.elongisporus)，2株费比恩塞伯林德纳氏酵母(C.fabianii)，2株鲑鱼色掷孢酵母(S.salmonicolor)，1株亚罗酵母属(Y.keelungensis)，1株布拉特克鲁维酵母(K.blattae)；(5)马拉色菌属(Malassezia)2株，包括1株球形马拉色菌(M.globasa)和1株糠秕马拉色菌(M.furfur)；(6)1株小孢蒲头霉(M.microspora)；1株无绿藻(Prototheca)；1株小孢蛙粪霉(B.microsporus)；1株海豚镰刀菌(F.delphinoides)；1株马尔尼菲篮状菌(T.marneffei)；1株荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)；1株Diutinaranongensis；1株冠耳霉(C.coronatus)；1株泡状莫氏黑粉菌(Moesziomycesbullatus)；4株皮炎外瓶霉(E.dermatitidis)； 1株Cutaneotrichosporoncurvatum(曾名Cryptococcuscurvatum)；(7)细菌包括罗氏菌(Rothia)1株，犬咬二氧化碳嗜纤维菌(C.cynodegmi)1株。

标准菌株包括：新型隐球菌ATCC 32045，格特隐球菌ATCC MYA-4560，浅白隐球菌ATCC 60030，罗伦特隐球菌ATCC 60036，季也蒙念珠菌ATCC 6260，白念珠菌ATCC 90029，白念珠菌ATCC 90028，白念珠菌ATCC 14053，克柔念珠菌ATCC 6258，近平滑念珠菌ATCC 22019。

1.2试剂、培养基和仪器 考核试剂：隐球菌荚膜多糖检测(胶体金法)试剂[批号：200601，丹娜(天津)生物科技股份有限公司]，对比试剂：隐球菌抗原检测(胶体金免疫层析法)试剂(批号:L106845，美国Immuno Mycologics公司)，SDA琼脂粉、科玛嘉琼脂粉(法国生物梅里埃公司)，SDA平板、科玛嘉平板为实验室自制，0.9%灭菌生理盐水(批号：Y1910245W，华润双鹤药业公司)；Densicheck Plus电子比浊仪(法国生物梅里埃公司)。

1.3方法

1.3.1特异性检测 待检菌株复苏后传代1次，孵育24 h(个别菌株根据其生长状况而定)后进行实验。将SDA平板上生长的菌株用0.9%灭菌生理盐水配制0.5麦氏浊度单位(0.5 M)菌悬液，检测试剂的特异性。考核试剂检测步骤：吸取80 μL待检菌液，缓慢加入检测卡加样孔中，15～20 min读取结果。对比试剂检测步骤：加1滴样本稀释液于1.5 mL Ep管中，再加入40 μL待检菌液，插入胶体金试纸条，10 min后读取结果。使用考核试剂盒自带的阴性和阳性对照品进行质量控制。对有疑问的结果进行复检。结果判读后记录结果，并拍照存档。采用双盲方式进行，排除人为因素的干扰。

1.3.2灵敏度检测 对上述0.5 M阳性的菌液(共31株)，用0.9%灭菌生理盐水以10倍倍比稀释，按1∶10、1∶100、1∶1 000的顺序进行检测,直至检测结果为阴性，同时取1∶10 000稀释菌液10 μL均匀涂布于SDA平板进行菌落计数，对有疑问的结果进行复检，记录结果并拍照存档。

1.3.3钩状效应(HOOK效应)检测 将23株0.5 M菌液检测为阳性的菌株，用0.9%灭菌生理盐水重新配制2 M和4 M浓度菌液，检测试剂钩状效应。记录结果并拍照存档。

1.3.4结果判读 测试区(T线)和质控区(C线)同时出现显色条带时为阳性结果；仅质控区(C)出现条带为阴性结果；质控区(C)未出现条带者判为无效，应重检。选择光线充足的环境判读结果，对显色较弱的结果判读应至少由两人(或以上)进行复核。该检测方法(免疫层析法)为定性检测，只要出现条带即为阳性，不存在灰区(即弱阳性结果)。考核试剂和对比试剂均参照以上判读结果。

2 结果

2.1质控结果 考核试剂盒自带阴性和阳性质控品检测结果良好。

2.2特异性检测结果 待测试剂检测隐球菌属31株，阳性25株(新型隐球菌和格特隐球菌均为阳性)，阴性6株。16株毛孢子菌，阳性12株，阴性4株。1株Cutaneotrichosporoncurvatum检测结果为阳性。4株皮炎外瓶霉检测结果均为阴性。11株念珠菌检测结果均为阴性。24株酵母菌检测结果均为阴性。2株马拉色菌检测结果均为阴性。小孢蒲头霉、无绿藻、小孢蛙粪霉、海豚镰刀菌、马尔尼菲篮状菌、荚膜组织胞浆菌、Diutinaranongensis、冠耳霉、罗氏菌、犬咬二氧化碳嗜纤维菌各1株，检测结果均为阴性。考核试剂检测结果与对比试剂检测结果一致。

2.3灵敏度检测结果 隐球菌的最低检出限为1.0×101CFU/mL；有10株菌(包括6株隐球菌和4株毛孢子菌)的判读结果对比试剂低于考核试剂1个稀释度，见图1，其他结果均一致。见表1。

图1 同稀释度标本考核试剂(上)阳性而比对试剂(下)阴性

表1 2种试剂的灵敏度检测结果

2.4钩状效应的检测 选定23株0.5 M菌液阳性的菌株，配制这些菌株2 M和4 M浓度菌液，考核试剂与对比试剂检测结果均未出现钩状效应。

2.5不同类型标本 对同一患者(确诊为肺隐球菌病)的血液、尿液和脑脊液，分别用考核试剂和对比试剂进行隐球菌荚膜多糖抗原检测，结果显示血液和尿液结果呈阳性，脑脊液呈阴性，2个试剂的结果一致，见图2。

注：上，尿液；中，血液；下，脑脊液。

3 讨论

隐球菌属(Cryptococcus)有性期隶属于真菌界，担子菌门(Basidiomycota)，银耳纲(Tremellomycetes)，线黑粉菌目(Filobasidiales)，线黑粉菌科(Filobasidiaceae);无性期隶属于半知菌门，芽孢纲，隐球酵母目，隐球酵母科。属内包括17个种和8个变种，新型隐球菌格鲁比变种(C.neoformansvar.grubii)，新型隐球菌新型变种(C.neoformansvar.neoformans)和格特隐球菌(C.gattii)被认为是可感染人类的病原菌。按血清学分为A、B、C、D和AD型5个型。已报道可引起人类疾病的还有浅黄隐球菌(C.luteolus)、浅白隐球菌(C.albidus)、罗伦特隐球菌(C.laurentii)、地生隐球菌(C.terreus)和指甲隐球菌(C.uniguttulatus)等。隐球菌为圆形或卵圆形，菌体直径一般为2～15 μm，大者可达20 μm，革兰染色阳性。菌细胞常有出芽，但无真、假菌丝。自然界中的新型隐球菌大多与鸽子(包括其他鸟类)的粪便和鸟粪污染的土壤有关。格特隐球菌的环境栖息地最初被确定为桉树(赤桉)，还有一些其他树木考虑为污染源[4]。隐球菌可侵犯人和动物，一般为外源性感染，但也可致内源性感染，目前尚无可由人传人、动物传人、实验室获得性感染的证据，对人类而言，通常是条件致病菌。新型隐球菌首先经呼吸道侵入人体，由肺经血液播散时可侵犯所有脏器组织，主要侵犯肺、脑及脑膜，引起慢性脑膜炎，也可侵犯皮肤、骨、关节和心脏等部位。新型隐球菌病好发于细胞免疫功能低下者，如艾滋病、红斑狼疮、结节病、白血病、淋巴瘤、糖尿病、恶性肿瘤、器官移植及接受肿瘤坏死因子抑制剂或大剂量使用糖皮质激素者[5]。检测体液中的隐球菌荚膜多糖抗原，对隐球菌疾病的诊断非常重要[6]。有研究结果显示，其对隐球菌病的诊断敏感性和特异性达93%～100%[7]，敏感性远高于有关文献中研究的其他检测隐球菌的方法：痰培养3.0%，肺泡灌洗液培养36.4%，肺组织病理69.6%，肺组织培养75.0%[8]。

隐球菌荚膜多糖抗原的主要成分是葡萄糖醛酸-甘露聚糖(GXM，占90%～95%，实验所测抗原)，另含5%半乳甘露聚糖(GalXM)[9-10]。我们选取了隐球菌及与其有近缘关系的念珠菌和酵母菌。文献报道可能会引起假阳性的细菌(罗氏菌和犬咬二氧化碳嗜纤维菌)以及可能会引起肺部感染的一些真菌，例如毛孢子菌、马尔尼菲篮状菌、荚膜组织胞浆菌等作为检测对象，实验结果显示：部分毛孢子菌(包括阿萨希毛孢子菌，黏液毛孢子菌，真皮毛孢子菌，蒙得维地亚毛孢子菌，辜氏毛孢子菌，皮瘤毛孢子菌，圆形毛孢子菌，多哈毛孢子菌，T.coremiiforme)可出现阳性结果，这是由于其也含有GXM，出现了交叉反应[11]。考核试剂检测有交叉反应毛孢子菌的检出限范围为2.0×103～1.7×106CFU/mL，高于隐球菌的检出限范围(1.0×101～3.0×105CFU/mL)。毛孢子菌感染的病例相对较少，2009年至2016年，在中国医院侵袭性真菌监测网(CHIFNET)项目中共收集到133株毛孢子菌[12]。在日本，阿萨希毛孢子菌(Trichosporonasahii)和黏液毛孢子菌(Trichosporonmucoides)被认为是引起夏季型过敏性肺炎的主要病因[1,13]。因此，在怀疑肺部疾病真菌感染(隐球菌荚膜多糖抗原检测阳性)而针对隐球菌治疗无效时，临床医生应该考虑到毛孢子菌感染的可能性。另外，Cutaneotrichosporoncurvatum检测结果为阳性，是因为其之前被称为Cryptococcuscurvatus，是隐球菌属的一个种，2016年Hofmeyer等[14]已证实，其检出限为8.0×104CFU/mL。念珠菌、酵母菌、无绿藻、小孢蛙粪霉、海豚镰刀菌、马尔尼菲篮状菌、马拉色菌、荚膜组织胞浆菌、Diutinaranongensis、冠耳霉、小孢蒲头霉检测结果均为阴性，证明该试剂属外特异性较好。文献报道，可能引起假阳性的因素有：犬咬二氧化碳嗜纤维菌菌血症、恶性肿瘤、罗氏菌属菌血症、肥皂及消毒剂、羟乙基淀粉(用于液体复苏)[15-16]，本次实验罗氏菌和犬咬二氧化碳嗜纤维菌检测结果均为阴性。由实验结果可以看出，同一种菌不同菌株相同的菌量灵敏度也会有差异，可能与多糖荚膜抗原载量不均一有关。本次实验格特隐球菌最低检出限为1.0×101CFU/mL，证明待评价试剂有较高的敏感性。虽然考核试剂和对比试剂都是用胶体金包被抗体，但由于生产工艺不同，反应结果的显色带的清晰度也不同，在较弱阳性的样本结果判读时可能会出现判读误差，这也许是本次比对结果中有10株菌(包括6株隐球菌和4株毛孢子菌)的判读结果呈现考核试剂高于对比试剂一个稀释度的原因所在。若想减小人为判读的误差，可能需要用仪器进行判读。

可以用于检测隐球菌荚膜多糖抗原的体液包括血清、脑脊液、肺泡灌洗液、尿液等，除血液和脑脊液之外，用于其他体液的检测尚未批准[1]。另有文献指出，肺泡灌洗液隐球菌荚膜多糖检测敏感性可能会高于血清，可能的原因是：隐球菌在肺部浸润性生长，隐球菌荚膜多糖较难或早期尚未或较少释放入血，尤其是小病灶或无全身症状患者[17]。本次实验中对同一患者(确诊为肺隐球菌病)的血液、尿液和脑脊液分别用考核试剂和对比试剂进行了隐球菌荚膜多糖抗原检测，结果显示血液和尿液结果呈阳性反应，脑脊液呈阴性反应，2个试剂的结果一致，说明用脑脊液结果诊断肺隐球菌病可能会漏诊，用患者的尿液进行检测可能是一种补充选择。也希望厂家能够多报批一些样本类型的试剂供临床选择。

实验结果表明，2种试剂特异性无差异。灵敏度检测结果显示，隐球菌属内、属外共有10株菌考核试剂的检测灵敏度较对比试剂高一个稀释度，其中隐球菌属内有6株菌考核试剂的检测灵敏度较对比试剂高一个稀释度(包括2株格特隐球菌，1株新型隐球菌，1株新生隐球菌格鲁比变种，1株浅白隐球菌，1株乌兹别克斯坦隐球菌)，占检测阳性隐球菌的20%(5/25)，提示考核试剂的灵敏度高于比对试剂。在本次实验所达到的菌液浓度中，均未出现钩状效应。隐球菌荚膜多糖抗原胶体金免疫层析法检测试剂是性能较高的快速筛查手段，可以为临床诊治隐球菌病提供可靠的初步判定依据。