致血液感染的活泼瘤胃球菌的分离与鉴定*

周晓君，轩断断，张冠男，牛莉娜，苏屿，谭奇燕，邓垂文，王旭明

(1.海南医学院病原生物学教研室海南医学院—香港大学热带传染病联合实验室，海口571199；2.海南省人民医院 海南医学院附属海南医院检验科，海口 570311；3.中国医学科学院 北京协和医院风湿免疫科 国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心，北京100730)

活泼瘤胃球菌(Ruminococcusgnavus)为专性厌氧、无孢子、无动力或有动力、革兰阳性球菌，属于人类、牛、绵羊和山羊等肠道正常菌群。革兰阳性厌氧球菌(gram-positive anaerobic cocci, GPAC)约占临床厌氧致病菌的25%～30%[1]。国外有关活泼瘤胃球菌感染的报道偶见[2]，但国内相关报道罕见。本研究对1例结肠息肉摘除后患者血培养中分离的活泼瘤胃球菌进行多种方法的鉴定，以辅助临床诊断治疗。

1 材料与方法

1.1临床资料 患者女，55岁，1个月前于外院行结肠镜检查，提示“升结肠可见一大小约2.5 cm×2.0 cm隆起突变，中央凹陷”，因“大便性状改变半年，发现结肠息肉1个月”于2020年8月3日入院就诊。入院检查：体温36.5 ℃，清蛋白38.3 g/L，C反应蛋白、肾功能相关生化指标正常，血常规正常。行结肠息肉摘除术后第6天，患者发热，寒颤，体温39.2 ℃，清蛋白37.3 g/L，C反应蛋白29.22 mg/L，降钙素原0.275 ng/mL，血液检查：白细胞14.97×109/L，中性粒细胞比例90.4%，不排除感染。留2套血培养检查。血培养第3天2瓶厌氧血培养瓶报告阳性，涂片可见革兰阳性球菌，呈单个或链状排列。需氧瓶未见报告阳性警告，结合患者症状，考虑血源性感染。根据《国家抗微生物治疗指南》和β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用专家共识(2020年版)[3]，给予头孢哌酮钠/他唑巴坦抗感染治疗，每次2 g，每天2次，静脉滴注。血培养第4天报告：血培养有厌氧菌活泼瘤胃球菌生长。继续抗感染7 d，患者无寒颤发热，白细胞正常，C反应蛋白正常，术后恢复顺利，给予出院。

1.2主要试剂与仪器 哥伦比亚血琼脂平板、不加抗生素巧克力平板、厌氧培养基(郑州安图生物公司)，质控菌株大肠埃希菌 ATCC 8739(法国生物梅里埃公司)，DNA提取试剂盒Wizard Genomic DNA Purification Kit(美国Promega公司)，PCR扩增引物由广州天一辉远公司合成；Vitek 2 Compat全自动生化鉴定系统及配套厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡(ANC)、Vitek MS微生物MALDI-TOF MS鉴定仪及靶板、基质液和甲酸(法国生物梅里埃公司)，PCR仪(美国Eppendorf公司)，DYY-6G型电泳仪(北京六一仪器厂)，ABI 3730XL自动测序仪(美国Applied Biosystem公司)。

1.3细菌培养 抽取血培养阳性肉汤，直接涂片革兰染色镜检，同时接种于哥伦比亚血平板，巧克力平板(不加抗菌药物)和厌氧血平板，5% CO2培养箱37 ℃温育24 h，哥伦比亚血平板、巧克力平板(不加抗菌药物)均无细菌生长，厌氧血平板可见灰白色半透明菌落。将初代厌氧血平板菌落进行耐氧试验，获得专性厌氧菌并进行革兰染色镜检，触酶试验观察生化反应特性。用Vitek 2 Compact全自动生化鉴定系统及ANC卡进行生化鉴定试验。

1.4基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定 用无菌接种环取菌并均匀涂于靶板，加入1 μL α-氰基-4-羟基肉桂酸+乙腈(CHCA)基质液，待完全干燥后，使用MALDI-TOF MS鉴定，将所得质谱图与MALDI-TOF MS RUO数据库中的质谱图进行匹配。

1.516S rRNA基因检测 取厌氧哥伦比亚血平板上的菌落按Wizard Genomic DNA Purification kit说明书提取基因组DNA。PCR扩增基因组DNA 16S rRNA基因，按试剂盒说明书操作，正向引物：5′-AG

TTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACC

TTGTTACGACTT-3′。反应体系: DNA提取物1 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,2×PCR Mix 10 μL，ddH2O补足至20 μL。反应条件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，使用自动凝胶成像系统分析。将琼脂糖凝胶分离的目的条带，用PG溶胶液溶胶，磁珠纯化吸附DNA，酒精去杂质，最后洗脱液(水)溶出DNA，得到纯化好的目的基因。由广州天一辉远公司在ABI 3730XL自动测序仪上进行双脱氧链终止法(Sanger法)测序，结果用GenBank数据库进行比对。用MEGA5软件构建分离菌的系统进化树。

2 结果

2.1细菌培养 专性厌氧血平板培养24 h后可见直径约1 mm的圆形、灰白色、半透明、湿润、边缘光滑的菌落，无溶血环(图1)。细菌革兰染色阳性，着色弱，球形或类球形，单个、成对或链状排列(图2)，触酶试验阴性，H2S试验阳性,分解葡萄糖，ANC卡生化试验:α-阿拉伯糖苷酶、d-2脱氧核糖、蔗糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖、七叶苷水解试验为阳性，ID信息置信水平结果显示：不能鉴定的细菌。

图1 厌氧平板培养24 h的菌落形态

图2 菌落涂片革兰染色

2.2细菌鉴定 分离菌株的MALDI-TOF MS质谱图与RUO数据库中已有的活泼瘤胃球菌质谱图比较，吻合度最高，鉴定为活泼瘤胃球菌，置信度为83.7%，见图3。菌落基因组16S rRNA PCR产物为1 446 bp,测序结果与已知活泼瘤胃球菌 ATCC 29149T序列号(NR 036800.1)16S rRNA基因同源性为99%，系统进化树分析显示分离菌与活泼瘤胃球菌ATCC 29149T位于同一分支(图4)，鉴定为活泼瘤胃球菌，登录号为MT998949.1。

图3 分离菌株的MALDI-TOF MS鉴定结果

图4 分离菌的系统进化树分析

3 讨论

活泼瘤胃球菌属于胃瘤菌属，可以引起过敏、狼疮性肾炎、脊椎关节炎和炎症性肠病，其与克罗恩病发生最为密切[4]。其致病机制不明，可能与人体B细胞反应相关[5]，也可能通过2,7-唾液酸酐产生并代谢N-乙酰神经氨酸，清除黏蛋白中的唾液酸获得营养优势[6]有关。

本分离菌株经耐氧试验证实该菌只在厌氧条件下生长，初步判断为厌氧菌。细菌生化等手工鉴定方法操作繁琐，鉴定时间长而且也只能鉴定出有限菌株。Vitek 2 Compat全自动生化鉴定结果显示为不能鉴定的细菌，可能原因有：该菌为专性厌氧菌，生化反应不活泼；菌株生化谱不典型；不符合Vitek 2数据库中的菌株分类群。近年来，随着MALDI-TOF MS在临床广泛应用，越来越多的疑难菌种被鉴定。本研究使用MALDI-TOF MS检测分离株，得到的质谱图与RUO数据库中已有的活泼瘤胃球菌质谱图比较，置信度为83.7%，与前研究一致。Fontanals等[7]发现血培养阳性标本经过处理，可以直接通过MALDI-TOF MS鉴定菌株。Fernández-Caso等[8]利用MALDI-TOF MS能够较好地鉴定出活泼瘤胃球菌。随着基因组学的兴起，分子生物学检测方法倍受关注，虽然16S rRNA检测价格昂贵，但是准确度高。本研究通过分离菌株16S rRNA测序，结果与GenBank数据库中Blast比对，显示该菌与活泼瘤胃球菌ATCC 29149T(序列号NR036800.1)的同源性为99%，由分离株的系统进化树可知，该分离菌与标准菌株活泼瘤胃球菌ATCC 29149T位于同一分支，鉴定为活泼瘤胃球菌，登录号为MT998949.1。

综上，本文患者分离菌株经MALDI-TOF MS与16S rRNA基因检测，鉴定为Ruminococcusgnavus。MALDI-TOF MS和16S rRNA是当前Ruminococcusgnavus临床菌株有效的鉴定方法，2种方法具有较好的应用前景。菌种快速鉴定不但可以对致病性病原菌进行快速诊断，辅助临床诊断治疗，为临床用药提供依据；又可以监测致病菌菌种分布情况。此外，菌种快速准确鉴定为早期预防公共卫生突发性病原传染性疾病提供了科学根据，同时为鉴别诊断提供了筛查手段。