婴幼儿沙眼衣原体肺炎的临床特征及基因型分布*

江杨华，李艳，代国知，罗丽裴，陈虹亮

(郴州市第一人民医院a.检验医学中心，b.血管外科，湖南郴州423000)

沙眼衣原体(Chlamydozoatrachomatis，CT)是引起性传播疾病的常见病原体之一，据报道全球每年约新增1.3亿病例[1]。由于该病原体可以通过多种机制逃避宿主的免疫反应[2]，大部分患者呈携带感染，表现为无症状，感染后常常被忽视，而延误治疗。感染CT的孕妇可以垂直传染给新生儿，引起沙眼衣原体肺炎。由于大部分孕妇在怀孕期间没有进行常规筛查和治疗，目前这种病原体仍然是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病原体。本研究拟通过调查分析湖南郴州地区3个月以内的婴幼儿沙眼衣原体肺炎的发病情况、临床特征、CT的基因型分布以及不同基因型CT的致病力差异，为临床对婴幼儿沙眼衣原体肺炎的诊治、预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2019年2月1日至2020年1月30日间在郴州市第一人民医院住院、年龄≤3个月的肺炎患儿719例，儿童来源分布于郴州地区各县市区。病例纳入标准：(1)发病年龄≤90 d；(2)符合婴幼儿感染性肺炎诊断：具有咳嗽、气促、发热、发绀等呼吸道症状；肺部听诊可闻及中细湿啰音或痰鸣音；具有双肺浸润影，肺门旁及内中带肺野间质条索影、片絮影、斑片影等影像学改变。排除标准：(1)先天性气道发育异常、胎粪吸入综合征、新生儿急性呼吸窘迫综合征患儿；(2)痰培养为真菌或百日咳的病例；(3)病例资料不全者。重症肺炎诊断标准[3]：(1)一般情况差；(2)拒食或脱水征；(3)意识障碍；(4)呼吸频率明显增快(婴儿RR>70次/分)；(5)紫绀；(6)呼吸困难(呻吟、鼻翼扇动、三凹征)；(7)多肺叶受累或≥2/3 肺受累；(8)胸腔积液；(9)血氧饱和度≤0.92；(10)肺外并发症。出现任何一项即诊断重症肺炎。根据研究对象肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中是否检出CT，将患儿分为CT感染患儿组94例和非CT感染患儿组625例。记录入院时婴儿的临床、实验室和影像学表现及出生时的有关情况。

1.2仪器及试剂 NP968C核酸提取仪及配套提取试剂(西安天隆公司)，ABI 7500荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)，ADVIA 2120i全自动血液分析仪、BNⅡ全自动特定蛋白分析仪(德国西门子公司)。沙眼衣原体(CT)核酸荧光定量检测试剂(湖南圣湘公司)，2×Taq Plus Master Mix(北京康为世纪公司)，引物由Invitrogen公司合成，C反应蛋白(CRP)测定(散射比浊法)试剂(德国西门子公司)。

1.3BALF采集 由临床医生采集，即在利多卡因气道黏膜麻醉下，经鼻部、会厌到达支气管各段开口，给予37 ℃生理盐水0.5～1 mL/kg进行支气管肺泡灌洗，收集BALF于无菌容器中送检。

1.4血液标本常规检验及BALF标本细胞形态分析 用散射比浊法在BNⅡ全自动特定蛋白分析仪上检测CRP，在ADVIA 2120i全自动血液分析仪上采用细胞化学染色、激光二维技术和流式细胞学相结合的方法进行血细胞计数。BALF标本采用改良版莱特-吉姆萨染色法获得各分类细胞计数，每个标本在光学显微镜下计数200个细胞，报告不同细胞类型在细胞总数中的比例。

1.5CT的初筛 采用实时荧光定量PCR方法，按照试剂盒说明书操作，病原体DNA拷贝数在500 copies/mL以上者定为阳性，每次PCR运行均包括阳性和阴性对照。

1.6CT分型 CT筛查阳性者用巢式PCR扩增编码CT主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)的ompA基因，参照GenBank中基因序列(accession number:gi1938326)设计引物。第一步PCR的引物为P1(5′-ATGAAAAAACTCTTGAAATC

G-3′)和P2(5′-CTCAACTGTAACTGCGTATTT-3′)，PCR反应体系体积为25 μL，包括2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，150 μg/mL DNA模板2 μL，去离子水8.5 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性60 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。第二步PCR采用第一步PCR的产物3 μL作为模板，引物为P3(5′-TGAACCAAGCCTTATGATCGACGGA-3′)和P4(5′-TCTTCGAYTTTAGGTTTAGATTGA-3′)，所有试剂量加倍，最终体积为50 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。巢式PCR检测阳性的产物送广州睿博公司，在ABI 3730XL全自动DNA测序仪上进行Sanger测序，将测序结果在NCBI中进行Blast比对，从而得到CT病原体ompA基因亚型的型别。

1.7统计学分析 用SPSS 19.0软件进行。正态分布的连续变量用均值±标准差表示，非正态分布以中位数(四分位数)表示，分类变量以例数和百分比表示。正态分布资料两组间比较采用两样本t检验，非正态分布资料两组间比较采用Mann-Whitney检验，计量资料比较采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1实时荧光定量PCR结果 719例入组的肺炎患儿中，采用实时荧光定量PCR方法初筛到CT阳性患者94例，阴性625例。阳性样本扩增曲线为典型的“S”型，并根据标准品进行定量，阳性CT含量为2.14×106(3.54×105,9.14×106)copies/mL，见图1。

注：1，强阳性CT检测样本；2、3、4、5，4个标准品，浓度分别为4×107、4×106、4×105、4×104 copies/mL。

2.2临床特征分析 CT感染患儿组与非CT感染患儿组比较，前者通过阴道分娩和犯哮喘的比例显著高于后者(P<0.05)；前者的产妇年龄显著低于后者(P<0.01)；而产妇分娩时胎龄的大小、患儿年龄、犯呼吸急促病的占比在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。在实验室检查指标中，前者的嗜酸性粒细胞计数明显高于后者(P<0.05)，而CRP、白细胞计数和中性粒细胞计数在两组中差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 CT感染患儿组与非CT感染患儿组参数比较

2.3CT感染患儿与非感染患儿BALF中细胞构成 CT感染患儿组BALF中嗜酸性粒细胞的比例明显高于非CT感染患儿组(P<0.01)，见图2；而中性粒细胞、淋巴细胞和吞噬细胞的比例，两者差异无统计学意义。见表2。

注：左图为CT阳性样本，箭头所示为嗜酸性粒细胞；右图为CT阴性样本。

表2 CT感染患儿组与非感染组BALF中细胞构成比较

2.4CT基因型分布及其与致病力关系 94例阳性样本用巢式PCR验证，92例为阳性，外送测序均有结果。经Blast比对，其中90例分型成功，2例失败。共检测到5种不同的CT基因型，分别为基因型D、E、F、G、J，基因型F占比最高，达50.00%；基因型E次之，为35.87%；基因型J占比最低，为2.17%。轻重症肺炎患者感染的CT基因型差异无统计意义(χ2=2.865，P=0.721)。见表3。

表3 沙眼衣原体的基因型分布及致病力差异[n(%)]

3 讨论

儿童沙眼衣原体肺炎多发生于3个月以内的婴幼儿，是婴幼儿肺炎常见发病原因之一。沙眼衣原体肺炎在婴幼儿中发病率的高低与产妇的感染率相关，且存在区域差异。据研究报道，在不到6个月婴幼儿中，沙眼衣原体肺炎的发病率为7%～30%[4-6]，并且随着年龄的下降，感染率呈上升趋势，越贫穷、卫生条件越差的地区感染率越高[7]。本文对本地区3个月内有呼吸道症状的719例婴幼儿检测发现，94例CT阳性，沙眼衣原体肺炎发病率为13.07%。

本文发现CT感染患儿组中婴幼儿通过阴道分娩的比例远高于非CT感染患儿组，说明阴道分娩会增加婴幼儿感染CT的概率从而引起沙眼衣原体肺炎。2009年Yu等[8]报道重庆市母亲阴道分娩时，CT的垂直传播率高达66.7%，充分证实了阴道分娩的高传染性，这与本文结果基本一致。本研究发现，CT感染患儿组其产妇平均年龄明显小于非CT感染患儿组，可能与年轻产妇性行为较活跃、性伴侣不稳定有关，导致CT感染率增高。

本研究还发现，CT感染患儿组外周血中嗜酸性粒细胞计数和BALF中嗜酸性粒细胞占比，均明显高于非CT感染患儿组。CT为胞内寄生病原体，小儿感染CT后，常常致病缓慢和延后诊断，以致引起哮喘、气促等呼吸道疾病，引起过敏反应而导致机体内的嗜酸性粒细胞增多。2011年印度Mishra等[9]报道，CT感染的婴儿中83.3%的患儿有嗜酸性粒细胞增多症，嗜酸性粒细胞计数的增大与CT感染显著相关，与本研究结论一致。

CTompA基因编码的MOMP被认为是引起宿主免疫反应的主要靶点，参与CT向宿主的黏附[10]。MOMP含有4个对称间隔的可变结构域，此结构域的改变可影响黏附作用，不同的结构域表现为不同的血清型(由ompA基因型决定)，因此推测不同ompA基因型的CT可能会引起致病程度的差异。本研究对本地区引起肺炎的CT的基因亚型进行分析发现：E和F型为主要亚型，F型占比最高；不同基因亚型的CT对所致肺炎的严重程度差异无统计学意义。2015年Li等[6]报道，深圳宝安区婴幼儿感染的CT主要为E型，这与本研究稍有不同，这可能与地区分布差异有关；而同样证实CT致病的严重程度与基因型无关，与本研究一致。

本文选择的人群代表性稍有欠缺，CT阳性例数偏少，并且巢式PCR方法检测的灵敏度(模板含量约为1×103copies/mL)相对较低，CT含量低时不能被检测到，这些因素可能导致结论会有偏差。

综上所述，沙眼衣原体肺炎在本地区3个月以下婴幼儿中普遍流行，阴道分娩增加感染率，同时嗜酸性粒细胞增多是CT感染的临床表现指标；本地区引起婴幼儿肺炎的CT基因亚型以E和F为主，尚未发现CT基因亚型与婴幼儿肺炎严重程度间的关联。