千年草提取物对人成纤维细胞胶原蛋白合成的影响及其抗衰老作用

徐艺丹 徐彬彬 韩银淑

(厦门医学院公共卫生与医学技术系医学美容教研室，福建 厦门 361023)

千年草是生长在韩国济州岛、牙山等地的一种仙人掌，被称为"手巴掌仙人掌"，是一种可食用仙人掌。该品种个头矮小，果实为红色，具有很强的抗寒能力，能耐受-5℃的酷寒〔1〕。其果肉富含多种蛋白质、维生素、微量元素等，营养丰富，仙人掌还具有抑菌、消炎、增强免疫力、降血糖、抗脂质过氧化、促进血液循环等多种药用价值，临床广泛用于治疗消化不良、胃痛、痢疾、痔血、咳嗽、糖尿病等多种疾病。除了食用价值和药用价值，研究报道仙人掌果实具有抗氧化性，能加速创口愈合，抗衰老，增加皮肤的柔软度，补充皮肤水分防止皮肤干燥，是保养皮肤的佳品〔2，3〕。本研究分别通过热水和乙醇提取千年草的皮、茎和籽，探究各种千年草仙人掌提取物体外抗氧化作用，及细胞内清除活性氧(ROS)作用，对细胞的增殖作用，对胶原蛋白合成的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 千年草仙人掌、1，1二苯基-2三硝基苯肼(DPPH)、偶氮二异丁脒盐酸盐(AAPH)购自Sigma 公司；人皮肤成纤维细胞系 HSAS1购自继和生物科技，其余化学试剂均为分析纯。电子天平购自上海精密仪器仪表有限公司；电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司；RE-5299(2L)旋转蒸发仪巩义市瑞力仪器有限公司；紫外光分光度计上海棱光技术有限公司；艾本德 5810R台式高速离心机；超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司。

1.2提取工艺 千年草分为籽、皮和茎三部分，经统一干燥，粉碎，过60目筛，得到对应的千年草仙人掌籽、皮、茎粉末。水提液:分别称千年草仙人掌籽、皮、茎粉末各10 g，分别加入250 ml 65℃热水，60℃水浴、200W超声功率浸泡提取1 h，抽虑，重复上述步骤3次，合并滤液，以3 000 r/min离心10 min，取上清液备用。乙醇提液∶分别称千年草仙人掌籽、皮、茎粉末各10 g，分别加入250 ml 60%乙醇，60℃水浴、200 W超声功率浸泡提取1 h，抽虑，重复上述步骤3次，合并滤液，以3 000 r/min离心10 min，取上清液备用。水提液和乙醇提液分别在60℃下减压旋转蒸发为10 ml，经冷冻干燥分别得到籽、皮和茎的干燥粉末。

1.3DPPH清除活性〔4〕在96孔板中依次加入不同浓度的千年草热水提物和乙醇提物100 μl和DPPH溶液，避光放置孵育30 min后，在517 nm波长处测定其吸光度(A1)。以等体积蒸馏水替代DPPH溶液，按上述步骤操作，测定吸光度值A2。以等体积的95%乙醇代替样品溶液作为空白对照，按上述步骤操作，测定吸光度(A3)。以Vit C(VC)为阳性对照，DPPH自由基清除率(%)=〔1-(A1-A2)/A3〕×100%，计算半抑制浓度IC50。

1.42，2联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)清除活性〔5〕在96孔板中依次加入不同浓度的千年草水提物和醇提物250 μl和ABTS溶液50 μl，避光放置孵育6 min后，在734 nm波长处测定其吸光度(A3)。以等体积蒸馏水替代ABTS溶液，按上述步骤操作，测定吸光度值A4。以等体积的95%乙醇代替样品溶液作为空白对照，按上述步骤操作，测定吸光度(A5)。以VC为阳性对照，ABTS自由基清除率(%)=〔1-(A3-A4)/A5〕×100%，计算半抑制浓度IC50。

1.5人皮肤成纤维细胞培养 将复苏后的人皮肤成纤维细胞置于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中进行传代培养，每2 d更换1次培养液，培养至对数期。

1.6千年草提取物细胞内 ROS清除活性将传代培养至第48代的人皮肤成纤维细胞配制成5×104个/ml的细胞悬浮液，于96孔培养板接种，培养24 h 后分别使用不同浓度的偶氮二异丁胀盐酸盐(AAPH)溶液处理2、4、6、8 h，采用2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯 (DCFHDA)试剂盒测定 ROS活性氧清除能力，所有操作严格按照试剂盒说明书进行，确定AAPH最佳造模浓度和处理时间。以最佳的AAPH浓度和造模时间为模型，37℃5%CO2培养，在细胞贴壁培养24 h后分别加入1、10、50、100 μg/ml浓度的热水提物和乙醇提物培养1 h(对照组加入等体积血清)后，加入最佳AAPH造模浓度进行最佳处理时间处理，处理完毕后，除去AAPH，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，再加入新鲜无血清培养基继续培养至16 h，使用2 μl DCFHDA荧光探针试剂盒进行ROS活性氧清除能力检测，使用荧光分光光度计检测拍照，激发波长为485 nm，发射波长为530 nm。

1.7千年草提取物的细胞增殖作用 配置1.6中细胞悬浮液于96孔培养板接种，待细胞贴壁生长24 h后分别加入1、10、50、100 μg/ml浓度的水提物和醇提物，每个浓度设置3个平行样，对照组加入等体积空白血清，37℃ 5%CO2培养72 h，用PBS冲洗，再加入2 mg/ml的噻唑蓝(MTT)溶液30 μl，继续培养4 h，除去上清液，加入150 μl DMSO，充分震荡，于570 nm波长下测定其吸光度值，与空白对照比较，计算细胞增殖率。

1.8千年草提取物对胶原蛋白合成的影响 将2 ml培养至对数期的人皮肤成纤维细胞以3×105个/ml浓度植入带有盖玻片的培养版中，盖玻片在培养前经多聚赖氨酸处理，用含10% FBS的DMEM培养液，培养24 h后，分别加入1、10、50、100 μg/ml浓度的千年草热水提物和乙醇提物，每个浓度设置3个平行样，对照组加入等体积血清，培养7 d后，使用 PBS缓冲液清洗盖玻片，然后用5%丙酮固定，使用H2O2去除过氧化物酶，加入一抗，37℃下孵育2 h，加入二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色，采用苏木素复染细胞核，中性树胶封固。使用光学显微镜观察，以棕黄色为阳性，每张盖玻片随机选择10个视野进行观察，通过LEICAQ软件进行灰度分析，观察Ⅰ型胶原蛋白的表达，灰度值越低表示Ⅰ型胶原蛋白含量越高。

1.9统计学方法 采用SPSS19.0软件进行χ2检验、单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1DPPH、ABTS清除活性 千年草籽、皮、茎的热水提取物和乙醇提取物的DPPH、ABTS清除率均随着浓度的增加而升高(P<0.05)。千年草提取物的DPPH、ABTS清除率均明显低于同等浓度的阳性对照组(P<0.05)。见表1、表2。千年草各部分提取物的DPPHIC50、 ABTS IC50值均明显高于阳性对照组(均P<0.05),千年草各部分提取物中，千年草籽乙醇提取物的DPPH、ABTS清除能力最强，见表3。

表1 千年草不同提取物及阳性对照组的DPPH清除率

表2 千年草不同提取物及阳性对照组的ABTS清除率

表3 千年草提取物 DPPH、ABTS清除活性

2.2千年草提取物细胞内ROS清除活性 随着千年草提取物浓度的升高人皮肤成纤维细胞ROS活性逐渐被抑制，其中，50 μg/ml，100 μg/ml 浓度的千年草籽乙醇提取物的ROS清除活性最强，见表4。

2.3千年草提取物的细胞增殖作用 随着千年草提取物浓度的升高人皮肤成纤维细胞的增殖率逐渐升高，与1 μg/ml千年草热水提取物和乙醇提取物相比，10 μg/ml以上浓度的对应部分的千年草提取物能够使人皮肤成纤维细胞的增殖率显著上升(P<0.05)，且100 μg/ml千年草籽的乙醇提取物和热水提取物的促进作用最强，见表4。

表4 千年草提取物对人皮肤成纤维细胞ROS清除活性的影响

2.4千年草提取物对胶原蛋白合成的影响 随着千年草提取物浓度的升高人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成率逐渐增强(P<0.05)，其中，浓度为50 μg/ml的千年草籽热水提取物胶原蛋白合成率最高，见表5。

表5 千年草提取物对人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成率的影响

3 讨 论

仙人掌含有多种多糖、生物碱、黄酮类、化黄酮合物、皂苷、蔽类等活性成分〔6〕，本研究分别采用热水浸提和乙醇浸提，提取物主要成分可能为粗多糖、多酚类、黄酮类物质，这类物质均具有良好的抗氧化活性。国内常见的米邦塔、仙巴掌、梨果仙人掌、量天和仙人掌都具有良好的清除自由基能力，文献报道这4种仙人掌的羟自由基清除活性低于芦丁〔7〕。本研究发现千年草提取物均具有清除DPPH、ABTS自由基活性，但其活性弱于同浓度的VC，各种提取物中，千年草籽乙醇提物的清除 DPPH、ABTS 自由基能力最强，IC50浓度最低。ROS 是一种强氧化剂，是细胞内代谢后的有害产物，活性氧包括氧自由基、丙二醛等，可以对脂质造成过氧化，损害细胞的脂质双分子层，加速细胞衰老，损害细胞功能，过量的ROS会损害胶原蛋白，引起皮肤松弛、产生皱纹，过量的ROS还会引起机体内氧化应激反应过度，引起多种疾病〔8〕。本研究结果表明千年草热水提取物和乙醇提取物对人皮肤成纤维细胞 ROS活性均具有抑制作用，其中千年草籽乙醇提取物的ROS抑制作用最强，说明千年草仙人掌具有一定的抗氧化、清除自由基能力，这与Cho等〔9〕报道有相似之处。但对于其发挥抗氧化清除自由基的具体有效成分还需进一步研究。

皮肤衰老和皮肤受损后的修复是一个复杂的生物学过程，成纤维细胞能够合成I型胶原蛋白活性，是重要的修复细胞之一。皮肤修复的生物过程通常是由成纤维细胞的增殖分化来完成的，人皮肤成纤维细胞是研究胶原蛋白、皮肤衰老的常用细胞模型〔10〕。研究认为人皮肤成纤维细胞的胶原蛋白分泌量在1 w左右达到峰值〔11〕。本研究发现千年草提取物在10 μg/ml以上时对人皮肤成纤维细胞增殖均有一定的促进作用，且随着浓度增加，其促进作用增强，同一浓度的不同提取方法及不同部位千年草提取物对人皮肤成纤维细胞的增殖作用无显著差异，说明千年草提取物无明显细胞毒性，且对Ⅰ型胶原蛋白的合成具有促进作用，随着浓度增加，促进作用增强，浓度为50 μg/ml的千年草籽热水提取物胶原蛋白增加率最高。牟丽秋等〔12〕采用杜仲提取液与MC3T3-EI成骨细胞在体外进行共培养，发现杜仲提取液具有促进细胞增殖、分化的作用，认为京尼平苷和绿原酸是促进其增殖的主要有效成分，京尼平苷和桃叶珊瑚苷是促进大鼠胶原蛋白合成的有效成分。ROS会促进胶原蛋白凋亡，引起细胞损伤，千年草提取物具有清除ROS活性，这可能是其对人皮肤成纤维细胞的增殖作用及对Ⅰ型胶原蛋白活性的促进作用、抗衰老的原因之一