黄芪甲苷对阿霉素诱导心力衰竭大鼠模型心室重构及心肌能量代谢的影响

张梦 全毅红 郭明星 甘盼盼 刘畅 黄芳

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院，湖北 武汉 430050)

据流行病学调查结果显示，欧洲老年心力衰竭患病率达6%～10%，5年存活率较低，且近年发病率呈不断上升趋势，不利于患者预后〔1〕。心力衰竭发病机制复杂，一项动物模型研究显示，心室重构是心力衰竭发展的重要环节，心肌细胞线粒体代谢障碍可导致心肌细胞凋亡，而心肌细胞凋亡是心室重构重要病理基础，可促进心力衰竭发展〔2，3〕。因此，保护心力衰竭患者线粒体结构及功能，抑制心肌细胞凋亡成为临床防治心力衰竭新靶点。目前，临床治疗心力衰竭患者常通过强心、利尿等对症支持治疗，虽可在一定程度上缓解患者症状，但整体效果不佳，辅以抗心肌细胞凋亡，预防心室重构等方式可提高治疗效果〔4～6〕。黄芪甲苷具有抗炎、改善心血管疾病等作用，还可调节内皮细胞功能，对心肌细胞具有一定保护作用，但具体机制尚未明确〔7〕。本研究通过阿霉素建立心力衰竭大鼠模型，并使用曲美他嗪、黄芪甲苷治疗，主要观察黄芪甲苷对大鼠心室重构及心肌能量代谢的影响，旨在指导未来心力衰竭的治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1实验动物 成年雄性SD大鼠40只，均购自山东大学医学院动物实验中心，大鼠均为清洁级，6～9周龄，平均(7.11±1.01)w；体重0.16～0.24 kg，平均(0.20±0.03)kg。饲养均在标准环境下，每12 h昼夜交替1次，保证大鼠得到充足的饮水及食物。

1.2方法

1.2.1主要药品与试剂 注射用盐酸阿霉素由山西普德药业有限公司提供，国药准字H14023879，规格：10 mg/瓶；黄芪甲苷由南京春秋生物工程有限公司提供，纯度为98%；盐酸曲美他嗪由南京正科医药股份有限公司提供，国药准字H20083803，规格20 mg/片；0.9%氯化钠注射液由成都科伦药业股份有限公司，国药准字H20181161，规格100 ml/瓶；原位末端转移酶标记技术(TUNEL)凋亡试剂盒、酶联免疫吸附试剂、免疫层分析法试剂盒均购自万类生物公司；北京乐普科技有限责任公司提供的LEPU Quant-Gold免疫定量分析仪。

1.2.2主要仪器与设备 加拿大VisualSonics公司提供的Vevo2100超高分辨率小动物超声成像系统；日本尼康公司提供的TE2000-s倒置荧光显微镜；广州威佳公司提供的JW-3021HR型高速台式离心机；德国莱卡公司提供的切片架；北京正开仪器有限公司提供的电子秤及低温冰箱；常州中威电子仪器厂提供的包埋机、石蜡切片机、组织漂烘仪。

1.2.3大鼠分组及处理

1.2.3.1分组 选取雄性SD大鼠40只，进行常规适应性饲养7 d后，随机选择其中10只大鼠作为空白对照组，另将30只大鼠通过阿霉素诱导建立心力衰竭模型，建模成功后随机分为3组，每组各10只，分别设为模型组、曲美他嗪组、黄芪甲苷组。

1.2.3.2建立心力衰竭大鼠模型 除空白对照组外，其余动物以3 mg/kg剂量阿霉素溶液腹腔注射；空白对照组给予等体积0.9氯化钠溶液注射，1次/w，共8 w，累积剂量为24 mg/kg，建立心力衰竭大鼠模型。造模结束后2 w颈总动脉插管测动物心功能，取心脏组织常规苏木素-伊红染色，进行病理组织检查；病理检查心肌呈心力衰竭样病变为建模成功。建模成功后，曲美他嗪组给予盐酸曲美他嗪10 mg/kg灌胃、黄芪甲苷组给予黄芪甲苷60 mg/kg灌胃，1次/d；连续给药8 w，剩余两组均给予同体积纯净水。

1.3相关指标检测

1.3.1心室重构指标检测法 干预结束后，称量大鼠体重并记录，固定大鼠，采用超高分辨率小动物超声成像系统测定各组大鼠左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)等心室重构指标。

1.3.2心肌细胞凋亡检测法 切片常规脱蜡、水化后，根据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书中实验步骤进行染色操作，于荧光显微镜下观察大鼠心肌细胞凋亡状况。每张切片选择5个视野(×400)，计算阳性细胞数，细胞凋亡指数(AI)=阳性细胞数/总细胞×100%，计算每个视野内AI并取平均值。

1.3.3心肌能量代谢指标检测法 干预结束后，取材前一天停止大鼠食物供给，可正常饮水，标本取材过程中，先用10%水合氯醛溶液，以0.3 ml/100 g剂量对大鼠进行腹腔注射，彻底麻醉后开胸暴露心脏，使用一次性真空采血管针经心尖部采集血液5 ml；收集血液置于恒温箱中静置30 min，2 000 r/min离心15 min，取出管内上清液，置于-80℃冰箱中待检。采用酶联免疫吸附试验检测血清N末端B型脑钠肽前体(NT-proBNP)水平；采用免疫层分析法检测血清心肌肌钙蛋白(CTn)I水平。

1.4统计学方法 应用SPSS20.0统计学软件进行Shapiro-Wilk正态性检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.14组大鼠心室重构指标比较 与空白对照组比较，其他3组LVEDD、LVESD显著升高，LVEF显著下降(P<0.05)；黄芪甲苷组、曲美他嗪组LVEDD、LVESD低于模型组，LVEF高于模型组(P<0.05)，且黄芪甲苷组LVEDD、LVESD低于曲美他嗪组，LVEF高于曲美他嗪组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组心室重构指标比较

2.24组大鼠心肌细胞AI比较 空白对照组心肌细胞AI为(1.76±0.26)%；模型组心肌细胞AI为(20.16±2.36)%；曲美他嗪组心肌细胞AI为(8.69±1.10)%；黄芪甲苷组心肌细胞AI为(4.72±1.03)%。与空白对照组比较，其他3组大鼠心肌细胞AI显著明显升高(P<0.05)；黄芪甲苷组、曲美他嗪组心肌细胞AI显著低于模型组(P<0.05)，且黄芪甲苷组心肌细胞AI显著低于曲美他嗪组(P<0.05)。

2.34组心肌能量代谢比较 与空白对照组比较，其他3组NT-proBNP、CTnI显著升高(P<0.05)；黄芪甲苷组、曲美他嗪组NT-proBNP、CTnI水平显著低于模型组(P<0.05)，且黄芪甲苷组NT-proBNP、CTnI水平显著低于曲美他嗪组(P<0.05)。见表2。

表2 4组心肌能量代谢比较

3 讨 论

传统医学认为心力衰竭与心肾阳气亏虚关系密切，而气虚与机体细胞能量荷值有关，心肌能量代谢障碍是心气虚的原因之一，故治疗心力衰竭应以补益心肾阳气为主，对改善心肌能量代谢具有重要作用〔8〕。黄芪甲苷是一种从黄芪中提取的高纯度药物，近年逐渐被临床应用心血管疾病治疗中，可维持心肌细胞内钙稳态，具有抗细胞凋亡、改善心肌能量代谢等作用〔9,10〕。动物模型研究显示，黄芪甲苷不仅具有保护肝脏、抗炎、镇痛等功效，还可加强机体心脏收缩力，保护心肌，起到抗心力衰竭等作用〔11〕。

心力衰竭因血流动力学负荷较重，加之炎症刺激可引起心肌结构及功能发生变化，随着心室重构不断发展，心肌损伤及心功能进一步恶化，进而出现心肌凋亡，心肌细胞凋亡的出现提示心力衰竭从代偿发展为失代偿〔12〕。本研究提示黄芪甲苷抑制心力衰竭心肌细胞凋亡作用更好，分析其原因可能与黄芪甲苷抗细胞凋亡机制有关。心室重构是心力衰竭的主要病理基础，故防治心室重构成为临床治疗心力衰竭新靶点。LVEF是左心室收缩功能量化的重要指标，是左心室单位容积内射血量，不仅可反映左心室射血效率，还是心室重构重要指标；LVEDD、LVESD也是临床常用的心室重构评估指标〔13〕。本研究结果提示黄芪甲苷用于心力衰竭的治疗，可在一定程度上预防心室重构。分析其原因可能为，黄芪甲苷中黄芪具有抗炎、调节免疫功能、抗细胞凋亡作用，而细胞凋亡是导致心室重构主要原因，故黄芪甲苷具有防治心室重构作用〔14〕。

心肌能量代谢异常在心力衰竭发生及发展过程中起到重要作用。NT-proBNP是脑尿纳肽的氮末端产物，具有利尿、扩血管等作用，参与心室重构整个过程，目前被临床广泛应用于心力衰竭诊断中〔15〕。研究显示，NT-proBNP水平升高与心功能损伤具有一定关系，其水平越高提示心肌受损程度越重，心肌能量代谢越差〔16〕。CTnI是一种理想的心肌细胞特异性标志物，也是目前临床诊断心肌损伤的重要指标之一，在心肌收缩及舒张中起到重要作用，对评估心肌能量代谢具有一定作用〔17〕。本研究结果提示黄芪甲苷可改善心力衰竭大鼠心肌能量代谢。陈彦等〔18〕研究显示，黄芪甲苷可通过调节心肌细胞能量代谢治疗心力衰竭患者，效果较好。该结果证实的药物的改善心肌能量代谢效果与本研究一致，进一步说明黄芪甲苷在心力衰竭中的应用价值之高。但因黄芪甲苷具体作用机制尚未明确，且临床实际中相关研究较少，故本研究结果真实性、可靠性及其是否对临床具有指导意义均需在未来展开较多的动物试验或临床研究加以验证。

综上所述，经阿霉素诱导的心力衰竭大鼠在经黄芪甲苷治疗后，心肌细胞凋亡抑制效果好，在防治心室重构方面意义重大，大鼠心肌能量代谢改善明显，应用价值高。