PD-1抑制剂对晚期非小细胞肺癌患者T淋巴细胞亚群、NK细胞及抑制性免疫检查点的影响

戴斌 黄翠萍 曹喆 吴甘霖 熊丽 胡一明 虞凯 谢青

(1湖北科技学院临床学院内科，湖北 咸宁 437100；咸宁市中心医院 2呼吸内科；3肿瘤科)

肺癌为我国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，我国2000～2014年登记地区的肺癌发病率呈缓慢上升趋势，男性患者发病年龄略有降低，农村地区患者有所上升〔1〕。非小细胞肺癌(NSCLC)包括鳞癌、腺癌和大细胞癌，NSCLC约为肺癌的80%，患者确诊为NSCLC时多处于中晚期，且患者年龄较高对化疗耐受性差，导致患者预后较差。近年来，程序性死亡分子(PD)-1与细胞程序性死亡-配体(PD-L)1结合所导致的免疫逃避作用已成为肿瘤治疗的有效靶点，为治疗晚期NSCLC带来了新的方向〔2〕。以纳武利尤单抗注射液为代表的PD-1抑制剂已在国内上市，然而在临床治疗过程中，PD-1抑制剂单独使用的响应率仅在20%～40%〔3〕，大部分患者未曾获益，PD-1抑制剂治疗前后患者T淋巴细胞亚群、自然杀伤(NK)细胞及抑制性免疫检查点如何变化值得进一步研究。本研究拟观察晚期NSCLC 患者应用PD-1治疗前后T淋巴细胞亚群、NK细胞及抑制性免疫检查点B和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、淋巴细胞活化因子(LAG3)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白(TIM3)的表达水平，推断其变化与临床疗效之间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究经湖北科技学院附属第一医院(咸宁市中心医院)医学伦理委员会批准，选择咸宁市中心医院呼吸内科、肿瘤科2018年10月至2019年12月收治的晚期NSCLC患者。纳入标准：①患者化疗方案为铂类，或接受表皮生长因子受体抑制剂，或接受间变性淋巴瘤激酶抑制剂，经上述方案治疗后影像学诊断为进展；②根据国际抗癌联盟(UICC)第8版TNM分期为ⅢB期和Ⅳ期的患者；③患者Karnofsky功能状态评分≥60分，预期寿命超过6个月；④同意参与本项研究并签署知情同意书。排除标准：①患者心肺功能不全；②合并严重心脑血管疾病；③合并严重肝肾功能不全；④患者未完成2个周期化疗。最终纳入研究NSCLC患者28例，平均年龄(59.1±12.2)岁；其中男17例、女11例；鳞癌 9例 、腺癌13例、 大细胞癌6例；ⅢB期13例、Ⅳ期15例。经过6个周期治疗后，9例患者被评估为PD分为治疗无效组，SD 13例、PR 3例分为治疗有效组。有2例患者因病情进展导致死亡，1例患者未能耐受免疫治疗，未纳入统计结果。

1.2方法 给予患者纳武利尤单抗注射液(100 mg/10 ml，百时美施贵宝，美国)，剂量为3 mg/kg，静脉滴注，滴注持续时间60 min，患者每2 w 1次，共进行6个周期的治疗。

1.3流式细胞仪检测 抽取患者治疗前1 d，治疗6个周期后，清晨空腹静脉血5 ml，每名患者采集2次，吸取100 μl静脉血加入流式管，并编号，吸取异硫氰酸荧光素(FITC)-CD3、FITC-CD4、藻红蛋白(PE)-CD8、PE-CD56、PE-LAG3、PE-BTLA、PE-TIM3单克隆抗体(BD公司，美国)10 μl至流式管中，震荡混匀，4℃避光孵育20 min后，加入红细胞裂解液500 μl，震荡混匀后，避光孵育15 min，随后加入预冷PBS 500 μl，震荡混匀后，4℃避光静置终止裂解，4℃离心(1 200 r/min，5 min)后，吸弃上清，随后加入预冷PBS 400 μl，采用流式细胞仪(FACSVerse，BD公司，美国)检测，Flowjo软件处理流式结果。

1.4疗效及不良反应评价 采用实体瘤疗效评价标准(RECIST)1.1对患者疗效进行评价〔4〕，患者至少具有一个可供测量病灶，通过CT、磁共振成像(MRI)等影像学手段，对患者肿瘤病灶的最大直径进行测量。评价标准如下，完全缓解(CR)：所有肿瘤病灶消失；部分缓解(PR)：基线肿瘤病灶最大直径总和缩小>30%；病情稳定(SD)：基线肿瘤病灶最大直径总和有所缩小但未达PR或者增加未达病情进展(PD)；PD：基线肿瘤病灶最大直径总和增加>20%或者发现新的肿瘤病灶。两组不良反应评价按照抗癌药物毒副反应分级标准进行分级评价〔5〕。

1.5统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1两组治疗前后T淋巴细胞亚群及NK细胞的比较 与治疗前相比，治疗后有效组CD4+、CD4+/CD8+明显升高、CD8+明显降低，与无效组相比差异有统计学意义(均P<0.05)，CD8+、NK细胞治疗前后两组比较差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

2.2两组治疗前后抑制性免疫检查点比较 治疗前有效组BTLA在CD8+的表达明显低于无效组、LAG3在CD4+、CD8+、NK细胞表达明显高于无效组，治疗后有效组BTLA在CD4+、CD8+的表达明显高于无效组，LAG3在CD4+、CD8+、NK细胞表达明显低于无效组，TIM3在CD8+、NK细胞表达明显高于无效组(均P<0.05)，见表2。

2.3不良反应 有效组不良反应发生率为68.75%，其中皮疹3例，发热2例，疲乏2例，消化道症状3例为Ⅰ～Ⅱ级反应，1例甲状腺功能减退为Ⅲ级反应，无效组不良反应发生率为66.67%，其中皮疹1例，发热2例，疲乏1例，消化道症状1例为Ⅰ～Ⅱ级反应，1例骨髓抑制为Ⅲ～Ⅳ级反应，两组不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 两组治疗前后T淋巴细胞亚群及NK细胞的比较

表2 两组治疗前后抑制性免疫检查点比较

3 讨 论

PD-1是一种重要的免疫抑制分子，活化的T细胞、B细胞、树突状细胞、不同肿瘤浸润淋巴细胞等均有PD-1表达。NSCLC发展进程中，肿瘤细胞通过表达PD-1、PD-L1，招募大量免疫抑制细胞及细胞因子，促使肿瘤微环境向免疫抑制转化，最终导致肿瘤细胞逃避机体免疫系统监视，促进肿瘤发生及进展〔6〕。NSCLC进展迅速，多数患者确诊时为晚期，NSCLC患者目前的生存现状及预后均不容乐观，以纳武利尤单抗注射液为代表的PD-1抑制剂为治疗NSCLC提供了新的手段〔7〕。

在NSCLC发展进程中，肿瘤特异性T细胞的凋亡受PD-1依赖和非依赖机制介导，PD-1依赖机制能够促进NSCLC患者中的肿瘤细胞发生免疫逃逸。研究发现外周血淋巴细胞免疫亚群比例在NSCLC患者中可出现异常，NSCLC患者外周血CD8+细胞增多，CD4+细胞下降，CD4+/CD8+降低，肿瘤细胞发生免疫逃逸，而肿瘤负荷解除时，出现异常的淋巴细胞亚群可逐渐恢复〔8〕，此外PD-1抑制剂在临床应用过程中，NSCLC患者对其响应率并不高。因此有必要选择T淋巴细胞亚群及NK细胞的变化，作为监测PD-1抑制剂治疗NSCLC患者的疗效及预后指标。本研究提示对PD-1抑制剂响应率较高的NSCLC患者，治疗后T淋巴细胞的功能够恢复。

肿瘤细胞发生免疫逃逸时，抑制性免疫检查点的变化为其不可缺少的一部分，PD-1抑制剂治疗NSCLC过程中，抑制性免疫检查点的表达水平既反映了肿瘤的免疫情况也反映了免疫治疗对患者免疫功能的影响〔9〕。BTLA激活后能够抑制T淋巴细胞亚群中CD3+的表达，在T淋巴细胞早期活化阶段BTLA发挥着负性调节，同时BTLA在肿瘤患者抗肿瘤免疫应答中具有重要作用〔10〕。本研究提示NSCLC患者对PD-1抑制剂的响应可能与BTLA在CD4+、CD8+表达动态变化相关。LAG3能够负向调节T淋巴细胞亚群中CD4+、CD8+的表达，LAG3和PD-1在肿瘤组织中共表达，同时阻断LAG3和PD-1可恢复T淋巴细胞抗肿瘤作用〔11〕。本研究提示NSCLC患者对PD-1抑制剂的响应可能与LAG-3的表达持续动态变化相关。TIM3具有诱导效应T淋巴细胞增殖、增强T淋巴细胞亚群CD8+毒性的作用，此外受肿瘤浸润的树突状细胞表达的TIM3，能够阻断树突状细胞与死亡肿瘤细胞释放的DNA结合，固有免疫细胞的抗原递呈受其影响降低，抑制固有免疫〔12〕，TIM3及PD-1同时阻断时，T淋巴细胞耗竭受逆转并且其抗肿瘤免疫功能恢复〔13〕。本研究提示NSCLC患者在接受PD-1抑制剂治疗时，患者TIM3在CD8+、NK细胞的表达可能与治疗效果相关。

研究表明，纳武利尤单抗治疗过程中常见不良反应为疲乏、皮疹、发热，甲状腺功能减退〔14〕。本研究提示PD-1抑制剂在NSCLC患者使用中耐受性较好。

综上，晚期NSCLC患者接受PD-1抑制剂治疗时，不良反应可耐受，T淋巴细胞亚群及抑制性免疫检查点可出现变化，而无效患者T淋巴细胞亚群及抑制性免疫检查点变化并不明显，可能与患者自身基础免疫低下相关。本研究提示，抑制性免疫检查点可作为监测NSCLC患者接受PD-1抑制剂治疗时免疫状态的监测指标。然而PD-1抑制剂国内上市时间较短，治疗费用高昂，目前临床应用较少，需要进一步的扩大样本，动态监测NSCLC患者治疗过程中T淋巴细胞亚群及抑制性免疫检查点的变化。