miR-296对人肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响

刘洋，夏书月，武晶晶

（1.沈阳医学院附属中心医院呼吸与危重症医学科，沈阳 110024；2.中国医科大学生命科学学院医学遗传学教研室，沈阳 110122）

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，恶性肿瘤致死病因中肺癌占27%，位于恶性肿瘤首位［1］。根据组织病理学特性将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占80%～85%。相对于其他类型的肺癌，NSCLC增殖、迁移较快，约75%患者发现时已处于中晚期，患者5年生存率较低［2］。

微小RNA是长约22 nt的非编码RNA，它能与目标靶基因特异性结合，通过调控靶基因的表达参与调控细胞分化、增殖、迁移以及凋亡等生理过程，在糖尿病、心力衰竭以及肿瘤等多种疾病的病理生理发展过程中发挥重要作用。研究［3-10］表明微小RNA-296（microRNA-296，miR-296）与结直肠癌、肝癌、胶质母细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌等肿瘤的发生密切相关，提示miR-296在肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用。然而目前关于miR-296对NSCLC的调控作用尚不清楚。本研究探讨miR-296在NSCLC增殖、凋亡和迁移等恶性生物学行为中的作用及其潜在的分子机制，旨在为NSCLC的治疗及研究提供新的理论依据及思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及细胞株

人肺腺癌细胞系 A549细胞（中科院上海细胞库），DMEM/F12培养基［以色列Biological Industries（BI）公司］，胎牛血清（美国Hyclone公司），miR-296抑制剂、阴性对照、引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］，jetPRIME 转染试剂（美国 Polyplus Transfection公司），TRIzol（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒、universal SYBR qPCR master mix试剂盒、miRNA提取试剂盒、miRNA反转录试剂盒、miRNA universal SYBR qPCR master mix试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒（中国诺唯赞公司），细胞培养瓶、6孔板、24孔板、96孔板，Transwell小室（美国Corning公司），CCK8细胞增殖检测试剂盒（美国 Abbkine公司）、细胞凋亡试剂盒（日本东仁公司），结晶紫染液（北京索莱宝科技有限公司），BCA蛋白浓度检测试剂盒（中国碧云天公司），S100A4抗体（美国 Abbkine公司），Tublin抗体（中国Proteintech公司）。

1.2 细胞培养、分组及转染

含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，在37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中培养A549细胞，倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞密度达80%～90%后，0.5%胰蛋白酶消化，按照1 ∶2传代培养。取对数生长期的细胞，2×105/孔接种于细胞培养板中，待细胞生长融合至60%左右时，按照jetPRIME 转染试剂说明书，分别将miR-296表达载体、抑制剂及相应阴性对照转染细胞。设置空白对照（Control）组、miR-296过表达［miR-296（+）］组、miR-296过表达阴性对照 ［miR-296（-）］组、miR-296 抑制剂（inhibitor）组、miR-296抑制剂阴性对照（inhibitor NC）组。

1.3 实时荧光定量PCR

TRIzol-氯仿法提取细胞总RNA，茎环法反转录成cDNA，再以cDNA为模板，在Bio-rad CFX Connect系统中进行实时荧光定量PCR。引物序列：miR-296反转录引物，GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGGATACGACACAGGA；miR-296上游引物，5’-GAGGGCCCCCCCTCAA-3’，下游引物，5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；RNU6-1上游引物，5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以RNU6-1为内对照，Bio-rad CFX Manager 3.1软件分析并计算Ct值。

1.4 CCK8法测定细胞增殖能力

转染A549细胞24 h后收集细胞，根据分组制成单细胞悬液并在显微镜下计数，按2×103/孔细胞接种于96孔板中，每孔加入100 μL培养液，培养箱中继续培养（12、24、48、72、96 h），每孔加10 μL CCK-8溶液，在培养箱中继续孵育1 h，利用多功能酶标仪测定450 nm波长处的吸光度（optical density，OD）值，并绘制细胞生长曲线。

1.5 平板克隆形成实验

细胞转染24 h后，胰蛋白酶消化制成细胞悬液，以2×103/孔细胞铺于6孔板中，反复吹打并摇匀，使细胞均匀分散，继续培养至每个集落＞50个细胞，4%多聚甲醛固定细胞15 min，0.1%结晶紫染色30 min，在显微镜下计数并分析集落形成数。

1.6 凋亡实验

细胞转染72 h后胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，2 000 r/min离心5 min收集（1～5）×105个细胞，加入500 μL 结合缓冲液悬浮细胞，避光加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀，室温避光反应15 min，转至流式检测管进行流式细胞仪检测。

1.7 Transwell实验

细胞转染72 h后胰酶消化并用无血清 DMEM/F12 培养基重悬，计数细胞，将细胞密度调节成3×104/mL，取 100 μL 接种到 Transwell（8 μm 孔径）小室的上室，下室中注入650 μL含10%血清的DMEM/F12培养基，设置3个复孔，继续培养24 h。PBS冲洗小室，用棉签将上室中未迁移的细胞蘸去，用 4%多聚甲醛固定已迁移至膜底部的细胞30 min，结晶紫染色30 min，PBS冲洗小室内外，将小室的滤膜用刀片小心切下放在载玻片上，加盖玻片，中性树脂胶封片。显微镜下计数上、下、左、右和中5个视野的穿膜细胞数，各视野平均穿膜细胞数表示肿瘤细胞的迁移能力。

1.8 Western blotting检测

细胞转染72 h后RIPA常规提取细胞总蛋白，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明测定蛋白浓度。根据蛋白浓度调整各组样品体积，沸水煮10 min使蛋白充分变性，取30 μg蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，100 V电压50 min将凝胶中蛋白转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，S100A4抗体（1 ∶1 000稀释）、Tublin抗体（1 ∶2 000稀释）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，相应二抗（1 ∶5 000稀释）室温孵育1 h，TBST洗膜后，利用超敏ECL化学发光试剂盒、Bio-rad凝胶成像分析仪扫描分析蛋白丰度。

1.9 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，所有实验均重复3次，计量资料以表示，组间比较采用t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-296转染A549细胞转染效率的鉴定

结果显示，与miR-296（-）组比较，miR-296（+）组miR-296表达显著上调（P＜ 0.01）；与inhibitor NC组比较，inhibitor组miR-296表达显著下调（P＜ 0.01），见表1，表明转染成功。

2.2 miR-296对A549细胞增殖能力的影响

结果显示，转染48 h后，与Control组和miR-296（-）组比较，miR-296（+）组A549细胞OD值显著降低；与Control组和inhibitor NC组比较，inhibitor组A549细胞OD值则显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），说明miR-296对A549细胞的增殖能力起到抑制作用。见图1。

表1 各组A549细胞中miR-296表达、细胞克隆数量、凋亡、迁移能力比较Tab.1 Comparison of miR-296 expression，number of colonies，apoptosis，and migration in A549 cells

图1 miR-296对A549细胞增殖能力的影响Fig.1 Effect of miR-296 on the proliferation of A549 cells

2.3 miR-296对A549细胞克隆形成的影响

利用平板克隆技术分析miR-296对A549细胞克隆形成能力的影响，结果显示，与miR-296（-）组比较，miR-296（+）组A549细胞形成克隆体积更小、数量更少（P＜ 0.05），与inhibitor NC组和miR-296（+）组比较，inhibitor组A549细胞形成克隆体积更大、数量更多（P＜ 0.05，P＜ 0.01），说明miR-296能抑制A549细胞的克隆形成能力。见表1、图2。

2.4 miR-296对A549细胞凋亡的影响

流式Annexin-FITC/PI双染法分析miR-296对A549细胞凋亡率的影响，结果显示，与miR-296（-）组比较，miR-296（+）组A549细胞的凋亡率显著增加（P＜ 0.05）；与inhibitor NC组比较，inhibitor 组A549细胞的凋亡率显著减少（P＜ 0.05），说明miR-296促进A549细胞凋亡。见表1、图3。

2.5 miR-296对A549细胞迁移能力的影响

图2 miR-296对A549细胞克隆形成的影响Fig.2 Effect of miR-296 on clone formation potential of A549 cells.

图3 miR-296对A549细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of miR-296 on A549 cell apoptosis

Transwell细胞迁移实验分析miR-296对A549细胞迁移能力的影响，结果显示，与miR-296（-）组比较，miR-296（+）组A549细胞迁移能力显著降低（P＜ 0.01）；与inhibitor NC组和miR-296（+）组比较，inhibitor组A549细胞迁移能力显著升高（均P＜0.01），说明miR-296对A549细胞的迁移能力起到抑制作用。见表1、图4。

图4 miR-296对A549细胞迁移能力的影响 ×200Fig.4 Effect of miR-296 on the migration ability of A549 cells ×200

2.6 miR-296对A549细胞S100A4蛋白表达的影响

结果显示，与miR-296（-）组比较，miR-296（+）组A549细胞S100A4蛋白表达显著下调（P＜ 0.05），与inhibitor NC组和miR-296（+）组比较，inhibitor组A549细胞S100A4蛋白表达显著上调（P＜ 0.05，P＜0.01），说明miR-296抑制A549细胞S100A4蛋白表达。见图5。

3 讨论

NSCLC包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。与小细胞肺癌比较，NSCLC增殖、迁移相对较快，多数患者发现时已处于中晚期。因此，明确影响NSCLC增殖、迁移的因素是目前临床急需解决的难题。

近些年随着研究的不断深入，发现越来越多的微小RNA能够参与调控肿瘤细胞分化、增殖、凋亡、侵袭、转移及上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）等生物学特性，进而影响肿瘤的发生发展［11］。miR-296定位于20q13.32，具有高度的保守性，在许多生命活动中发挥着重要的调控作用。

图5 miR-296对A549细胞中S100A4蛋白表达的影响Fig.5 Eeffect of miR-296 on S100A4 levels in A549 cells.

大量证据表明miR-296参与肿瘤的调控作用，而且不同肿瘤中的调控作用亦不同。VAIRA 等［12］研究发现miR-296在许多肿瘤组织中表达缺失，且与结直肠癌、乳腺癌、胃癌、甲状腺癌、肝癌等肿瘤的转移密切相关。VAIRA 等［12］利用人乳腺癌细胞MDA-MB231证明了miR-296发挥着重要的肿瘤抑制作用。有研究［9］报道抑制miR-296能够通过诱导EMT促进卵巢癌细胞侵袭，而恢复miR-296表达后肿瘤增殖生长被抑制［12-13］，以上结果均表明miR-296发挥抑制肿瘤的作用。然而也有研究显示miR-296起到促进肿瘤生长的作用，LEE等［6］发现miR-296-5p 通过SOCS2/STAT3下调NF2受体和Caspase-8促进胶质母细胞瘤侵袭。本研究结果显示转染miR-296表达载体后，A549细胞增殖、克隆形成及细胞迁移能力显著降低，细胞凋亡率明显上升（均P＜ 0.05）；抑制miR-296后，A549细胞增殖、克隆形成及迁移能力显著升高，凋亡率降低（均P＜ 0.05），提示miR-296在A549细胞中发挥肿瘤抑制作用。

S100A4是S100 蛋白家族中的一员，是一种小Ca2+结合蛋白，正常组织中不表达或低表达，而在许多肿瘤（胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等［14-17］）中高表达，并且在恶性转化、血管生成、迁移和侵袭中发挥调控作用。有研究［18］表明miR-296通过靶向调控S100A4抑制结直肠癌EMT。本研究结果发现miR-296过表达时S100A4蛋白表达下调，而抑制miR-296表达S100A4蛋白表达上调，提示miR-296可能通过靶向调控S100A4表达影响A549细胞的恶性生物学行为。

综上所述，miR-296抑制人肺腺癌A549细胞的增殖、迁移，促进凋亡，其作用机制可能是通过靶向调控S100A4表达来实现的，本研究为NSCLC的临床治疗提供新的靶点和理论基础。目前，miR-296/S100A4调控人肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的具体机制尚不清楚，仍需进一步研究论证。