肺癌患者外周动脉血和静脉血循环肿瘤细胞含量的差异及其临床意义

厉为良 李永华 梁卫娟 吕丽辉 高鹏帅 杨玉波

肺癌已经成为主要的公共卫生问题之一，是当今世上死亡率最高的恶性肿瘤[1-2]，尽管在肺癌的诊治方面取得了重大进展，但肺癌的5年生存率即便是早期(Ⅰa1、Ⅰa2、Ⅰa3期)NSCLC也分别只有96.0%、87.2%和78.7%[3]，可见早期诊断、早期治疗以提高肺癌长期生存率仍然任重而道远。

CTC检测是一种新兴的液体活检技术，在肿瘤的早期诊断、个体化治疗等方面有较广泛的应用。CTC可在肿瘤发生发展的各个阶段检测到,但阳性率在血样本量为7.5 mL时也只有30.4%(38/125)～ 52.9% (18/34)[4-5]。CTC的阳性率低的原因除了CTC本身稀少、CTC富集方法不同[6-7]外，血样本的来源不同可能是问题的关键，即外周动脉血的CTC含量可能与外周静脉的CTC含量不同。鉴于此，本课题组对肺癌患者外周动、静脉血中CTC含量进行了对比研究。

资料与方法

一、研究设计和病例选择

本研究选取2018年3月至2019年7月在浙江大学明州医院和宁波东海医院经病理确诊肺癌患者46例进行外周动、静脉血CTC的自身对照研究，并获得其医学伦理委员会的批准。所有患者均获得知情同意。根据相关的临床资料、全身计算机断层扫描(CT)和正电子发射断层扫描(PET)、脑磁共振成像(MRI)及病理结果，参照国际肺癌研究协会(The International Association for The Study of Lung Cancer，IASLC)的第八版TNM分期建议[8]确定肿瘤分期。

二、研究方法

所有纳入研究的患者均同时在其同侧肢体采取外周动脉血(A组)和外周静脉血(V组)各5 mL,注入统一采用ACD 抗凝的真空采血管内，密封后立即颠倒混匀8次，室温(15～30 ℃)下保存，24小时内进行检测。采用免疫磁珠阴性富集联合免疫荧光原位杂交法(immunofluorescence in situ hybridization, imFISH)对CTC进行富集计数和鉴定[9](由广州达安临床检验中心负责检测，检测血标本量为3.2 mL)，从3.2 mL血标本量中检出1个CTC即确认为检出CTC，以此计算CTC检出率；以检出CTC>=2个/3.2 mL为CTC阳性的诊断界值，计算CTC阳性率。

三、统计学方法

结 果

一、入组病例基线特征

共有46例肺癌纳入本研究，其基线特征见表1。

二、CTC检测结果

检测结果显示：46例肺癌患者外周动脉血(A组)CTC平均含量明显高于外周静脉血(V组)的CTC平均含量，两组对比有显著性差异(t=2.533，P=0.015)；A组的CTC检出率(71.7%)明显高于V组(52.2%)，且有显著性差异(χ2=8.873，P=0.032)；A组的CTC阳性率(58.7%)明显高于V组(30.4%)，且有显著性差异(χ2= 8.435，P=0.040)。(见表2)。

不同TNM分期肺癌的外周动脉血和外周静脉血CTC阳性率的差异在Ⅰ期最明显，其外周动脉血CTC阳性率(50.0%)明显高于外周静脉血(14.3%)，且差异显著(χ2=8.857，P=0.013)，而其它三期的动静脉血CTC阳性率无明显差异。(见表3)。

表3 46例肺癌患者TNM分期与外周动脉血和外周静脉血CTC阳性率

讨 论

外周静脉采血是一种简单、微创的方法，一般患者都能接受CTC检测。但肺癌CTC的阳性率偏低，尤其在早期肺癌。Tanaka 等[4]用半自动系统(Semiautomated system)对125例确诊的原发性肺癌(其中31例有远处转移)检测其外周静脉血CTC，检测样本量为7.5 mL，检出率只有30.6%。Allard WJ等[6]报告用CellSearch系统检测了964 例远处转移癌的2183份外周静脉血标本，其CTC阳性率只有36%(诊断界值为CTC>=2个/7.5mL)。随着CTC检测技术的进步，CTC的检测水平也得到提升。Devriese LA等[7]采用免疫磁珠富集法 (Immunomagnetic bead enrichment)检测了46例晚期(advanced)非小细胞肺癌，其检出率为46%。 最近，Duan等[5]报告，对34例确诊的原发性肺癌(其中9例为浸润性癌)采用循环上皮细胞采集器(GILUPI Cellcollector)及免疫荧光染色法检测、鉴定其外周静脉血CTC，其CTC检出率可达52.9%(18/34)。

本研究同时对外周动脉血标本和外周静脉血标本进行检测，采用的是免疫磁珠阴性富集联合免疫荧光原位杂交法(immunofluorescence in situ hybridization, imFISH)[9]，检测血标本量为3.2mL。所得的外周静脉血的CTC检出率(52.2%)与最近的文献[5]结果相近。而同一检测方法所得的外周动脉血的CTC检出率(71.7%)则明显高于外周静脉血，也远远高于前述研究报告[4-7]的结果。这一结果提示肺癌CTC在外周动、静脉血中的含量是不同的。本研究发现，肺癌患者外周动脉血CTC含量(1.98 ± 1.73[个/3.2mL])明显高于外周静脉血CTC含量(1.39 ± 1.86 [个/3.2mL])(t=2.533，P=0.015)，验证了上述推测，也即检测外周动脉血CTC相比外周静脉血可获更高的检出率。这对于采用液体活检方法早期诊断肺癌和转归及疗效随访可能具有重要意义。实际上，如果以检出CTC>=2个/3.2mL为CTC阳性的诊断界值，本研究结果显示，外周动脉血的CTC阳性率(58.7%)明显高于外周静脉血的CTC阳性率(30.4%)(χ2=8.435，P=0.040)，尤其在早期(Ⅰ期)肺癌更有其优势，外周动脉血的CTC阳性率(50.0%)明显高于外周静脉血的CTC阳性率(14.3%)(χ2=8.857，P=0.013)，提示检测外周动脉血CTC相比外周静脉血能获得更早期的诊断，有利于肺癌的早期诊治。

肺癌患者外周动脉血CTC含量明显高于外周静脉血CTC含量的原因可能是CTC在循环系统中的损耗不同。CTC在血液中循环时可能会被隔离、滤过、破坏或清除,也可能会凋亡，大约只有0.01%的CTC才能形成转移灶[10-11]，这其中毛细血管网的作用更不能低估。众所周知，如果肺癌CTC从支气管静脉入血，则外周静脉血样本中的肺癌CTC要经过右心系统、肺动脉、肺循环毛细血管网、肺静脉、左心系统、主动脉及其分支系统、体循环毛细血管网和体静脉系统，其间要经过两个毛细血管网；而外周动脉血样本中的肺癌CTC则避开了体循环毛细血管网和体静脉系统。如果肺癌CTC自肺静脉入血，则外周静脉血样本中的肺癌CTC虽然避开了肺循环毛细血管网，但也要经过左心系统、主动脉及其分支系统、体循环毛细血管网和体静脉系统，其间也要经过一个毛细血管网；而外周动脉血样本的肺癌CTC则只经过左心系统和主动脉及其分支，完全避开了肺循环和体循环的两个毛细血管网和体静脉系统。从上可见，外周动脉血的肺癌CTC所受的损耗显然应该比外周静脉血的肺癌CTC少得多。也许，这就是肺癌患者外周动脉血CTC含量明显高于外周静脉血CTC含量的主要机理。

鉴于这一机理，对于肺癌来说，采集肺静脉血送检CTC以提高肺癌CTC检出率和阳性率可能是最有效的方法，因为唯一的肺静脉可接受整叶肺的肿瘤细胞入血，且不需要经过漫长的血液循环和任何毛细血管网。Reddy等[12]为了证实早期肺癌CTC的存在，对32例原发肺癌在肺切除前抽取肺静脉血检测CTC，结果显示其CTC检出率达62.5%(20/32)，且其含量显著高于外周静脉血。但是，肺静脉血标本只有在开胸手术的情况下才能采集，多为一次性。这是一种技术复杂、创伤较大、风险较高的非常规方法。为了诊断早期肺癌而去开胸采集肺静脉血显然是不现实的，它不适用于肺癌的早期诊断筛查和治疗后病情转归的随访。而采集外周动脉血(如桡动脉血、股动脉血等)却要简单的多，一般患者都能接受，适用于肺癌的早期诊断的多次筛查，也适用于治疗后病情转归的反复多次随访检测，和采集外周静脉血一样，是一种技术简单、创伤很小、风险很低、更有效，便于推广的常规方法。

综上所述，肺癌外周静脉血CTC的稀有性导致其CTC的低检测率和低阳性率，而外周动脉血CTC含量显著高于外周静脉血，检测外周动脉血CTC，使其CTC检出率和阳性率显著提升，有利于肺癌的早期诊断和肺癌治疗后疗效观察及转归随访。