电化学发光免疫分析法检测血清雌二醇的性能验证

张伟娟,江雅平,陈永传,任飒爽

1.北京善方医院检验科，北京 100027;2.北京大学第一医院检验科，北京 100034

雌二醇(E2)是一种甾体雌激素,主要由卵巢产生，睾丸和肾上腺皮质也可产生少量E2。在妊娠期，雌激素主要产生部位为胎盘，胎盘生成的E2可在胎儿体内转化为雌三醇。E2可参与女性的整个生殖过程，其中17β-雌二醇(17β-E2)的生物活性最强。E2在月经周期中可对下丘脑和垂体起到双向调节作用，不仅影响卵泡的募集和优势卵泡的排出，还影响卵母细胞着床。E2还可作为一种治疗剂，对女性卵巢17β-E2分泌不足进行补充。因此，准确检测E2在下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱性疾病、卵巢或睾丸肿瘤、肾上腺皮质增生症、不孕不育和辅助生殖中均有着非常重要的临床意义[1-2]。本研究对电化学发光免疫分析法(ECLIA)检测E2的正确度、精密度、分析测量范围、临床可报告范围、功能灵敏度、生物参考区间进行了评价，以明确其是否满足实验室用途和临床需求。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机选取北京善方医院2019年9月20日—12月20日采集的健康男性、卵泡期女性、排卵期女性、黄体期女性、绝经后女性血液标本各60份作为研究对象。

1.2仪器与试剂 罗氏Cobas 6000 e601全自动电化学发光免疫分析仪、配套的E2检测试剂(批号39402903)、配套校准品(批号36605901)、配套质控品(批号33009700、33009900)，以及2019年国家临床检验中心发放的第二次室间质量评价质控品(批号201921～201925)。

1.3方法

1.3.1正确度验证 参考美国临床和实验室标准协会(CLSI) EP15-A2文件[3]、《临床实验室管理学》[4]及文献[5]，采用2019年国家临床检验中心发放的第二次室间质量评价质控品(批号201921～201925)进行正确度验证，每个批号检测3次，计算平均值，将实测值与靶值进行比较，计算相对偏移，相对偏移≤±25%为可接受标准。

1.3.2精密度验证 参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)EP5-A2文件[6]，采用两个水平的质控品进行精密度验证。每天对两个水平质控品检测两批，每批重复检测两次，每批检测间隔时间>2 h，共检测20 d，得到80个可接受数据。计算批内和批间变异系数(CV)、均值、标准差，当符合国家临床检验中心室间质量评价标准,即批内CV<1/4允许总误差(6.25%)，批间CV<1/3允许总误差(8.33%)，以及基于生物学变异设定的质量规范(批内及批间CV<11.4%)时，通过验证。同时比较本研究得出的批内及批间CV与厂家声明的批内和批间CV间的差异。

1.3.3分析测量范围验证 参考NCCLS EP6-A文件[7]和文献[8]，选取新鲜高水平标本(H)和低水平标本(L)各1份，按如下比例配制成7份不同水平的待测标本：6H+0L、5H+1L、4H+2L、3H+3L、2H+4L、1H+5L、0H+6L。在2 h内对每份标本检测4次，求其均值，以实测值作为纵坐标，预期值作为横坐标，进行线性回归分析，排除非线性数据点，得出最佳拟合方程。

1.3.4临床可报告范围验证 选择E2水平在分析测量范围内的3份高水平标本S1、S2、S3，所对应的E2水平分别为10 371.0、9 220.0、5 945.0 pmol/L，用E2原装稀释液分别将上述标本稀释2、5、10倍，并进行检测，将实测值和预期值进行比较，计算相对偏差，以相对偏差<1/3美国临床实验室改进修正法案(CLIA)′88允许总误差为可接受标准。选取E2水平在分析测量范围外的标本S4(E2水平为11 568.0 pmol/L)，用E2原装稀释液进行2、5、10倍稀释，并进行检测，将实测值与预期值进行比较，计算相对偏差，以相对偏差<1/3 CLIA′88允许总误差为可接受标准。临床可报告范围上限=可接受的最大稀释倍数×分析测量范围上限。

1.3.5功能灵敏度验证 依据NCCLS EP17-A文件[9]，选择水平略高于检测下限的标本5份(A1、A2、A3、A3、A5)，每份标本每天检测1次，连续检测10 d，计算均值、标准差和CV。选取CV最接近20%的标本的平均水平作为功能灵敏度。

1.3.6生物参考区间验证 参考CLSI C28-A3c文件[10]和WS/T 402-2012[11]，将健康男性、卵泡期女性、排卵期女性、黄体期女性、绝经后女性的血液标本各60份用于生物参考区间验证，检测其血清E2水平，并与厂家给定的参考区间比较，以≤2例的检测结果在给定的参考区间外作为可接受标准。

1.4统计学处理 采用SPSS23.0软件进行数据分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用简单线性回归进行回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1正确度验证 5个批号质控品实测值与靶值的相对偏移均在可接受范围内(≤±25%)，验证通过。见表1。

表1 正确度验证结果

2.2精密度验证 低水平质控品批内和批间CV分别为1.40%和1.80%，高水平质控品批内和批间CV分别为0.80%和0.86%，符合国家临床检验中心室间质量评价标准[批内CV<1/4允许总误差(6.25%)，批间CV<1/3允许总误差(8.33%)]及基于生物学变异设定的质量规范(批内及批间CV<11.4%)。将本研究得出的批内和批间CV结果与厂家声明的批内和批间CV(低水平质控品批内和批间CV分别为2.40%和3.80%，高水平质控品批内和批间CV分别为1.20%和2.10%)比较，差异均无统计意义(P>0.05)，验证通过。见表2。

表2 精密度验证结果

2.3分析测量范围验证 实测值与预期值的线性回归方程为Y=1.018 2X+19.5，R2=0.999 8，E2检测结果在17.8～11 992.0 pmol/L范围内呈线性，证明厂家提供的分析测量范围(18.4～11 010.0 pmol/L)符合要求。见图1。

图1 E2预期值与实测值的线性回归图

2.4临床可报告范围验证 E2在分析测量范围内稀释2倍和5倍时相对偏差均<1/3 CLIA′88允许总误差，可接受；而稀释10倍后相对偏差>1/3 CLIA′88允许总误差，不可接受，因此高水平标本稀释后的检测值必须>881.0 pmol/L(厂家声明的稀释后最低检测值)。E2在分析测量范围外时，当稀释倍数为2、5、10倍时相对偏差均<1/3 CLIA′88允许总误差，因此可接受最大稀释倍数为10倍，与厂家声明的最大稀释倍数一致，临床可报告范围上限=可接受的最大稀释倍数×分析测量范围上限=10×11 010.0 pmol/L=110 100.0 pmol/L。见表3。

表3 临床可报告范围验证结果

2.5功能灵敏度验证 5份标本的CV如表4所示，CV最接近20%的标本水平为43.5 pmol/L，与厂家声明的功能灵敏度一致。

表4 功能灵敏度验证结果

2.6生物参考区间验证 卵泡期女性有2例检测结果超出参考区间，排卵期女性有2例检测结果超出参考区间，黄体期女性有1例检测结果超出参考区间，健康男性、绝经后女性检测结果均在参考区间范围内，结果均符合可接受标准。见表5。

表5 生物参考区间验证结果

3 讨 论

E2在人体血液中水平较低，但却起着非常重要的作用，尤其是在内分泌调节方面，许多内分泌相关疾病均与其有关，因此，E2的准确检测就显得尤为重要[12]。根据《临床实验室改进法规修正案》和ISO15189要求，必须在仪器运用于临床实验室前对仪器进行分析性能验证[13]。

本研究评价的E2检测系统正确度验证采用的是2019年国家临床检验中心发放的第二次室间质量评价质控品，其靶值是根据728个实验室的E2平均值计算而来，本研究5个批号的质控品实测值与靶值的相对偏移均在可接受范围内(≤±25%)，正确度验证通过。检测系统的精密度用于反映重复检测值间的一致性，本研究参考NCCLS EP5-A2文件，采用两个水平的质控品进行精密度验证，结果符合国家临床检验中心室间质量评价标准及基于生物学变异设定的质量规范。分析测量范围验证是从统计学和临床要求两个方面判定线性，对数据进行回归分析，得到最佳拟合方程[14]。本研究中，在17.8～11 992.0 pmol/L范围内E2检测结果呈线性，证明厂家提供的分析测量范围(18.4～11 010.0 pmol/L)符合要求。临床可报告范围上限为110 100.0 pmol/L，最大稀释倍数为10倍，当检测标本的水平超过临床可报告范围上限时需稀释后再进行检测，最大稀释倍数不能超过10倍，否则结果不可靠；高水平标本稀释后的检测值必须>881.0 pmol/L(厂家声明的稀释后最低检测值)，如果稀释后的检测值<881.0 pmol/L应把稀释倍数缩小，以保证稀释后的检测准确性。功能灵敏度是在低水平标本的基础上，用于区分“从有到无”的分析能力，本研究选择水平略高于E2检测下限的5份标本进行功能灵敏度验证，结果显示，CV最接近20%的标本水平为43.5 pmol/L，符合厂家声明的功能灵敏度标准[15]。生物参考区间是指项目检测结果在健康人群中的分布范围，是标本检测结果正常与否的参考依据。本研究随机选取健康男性、卵泡期女性、排卵期女性、黄体期女性、绝经后女性的血液标本各60份进行生物参考区间验证，与厂家给定的参考值比较，结果均通过验证，证实该生物参考区间可应用于临床。

综上所述，ECLIA检测血清E2的各项性能基本能满足临床实验室要求，且其简便易行、稳定性高、便于自动化，可为临床诊疗提供可靠的E2检测结果。