不同标本前处理方法对新型冠状病毒核酸检测结果的影响*

张相猛，徐秋芳，施怡茹，卢晓芸，赵锦江，徐瑞芳

上海市青浦区疾病预防控制中心微生物检验科，上海 201700

由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染所致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球大范围的暴发、流行[1]。人感染SARS-CoV-2后常出现乏力和呼吸道症状，如发热、咳嗽、气促和呼吸困难等[2]。SARS-CoV-2传染力强，易造成聚集性感染，其常规检测方法为实时荧光定量PCR[3]，主要针对SARS-CoV-2基因组中开放读码框1ab(ORF1ab)和核衣壳蛋白(N)基因进行检测[4]。SARS-CoV-2属于β属冠状病毒，对紫外线和热敏感，现在普遍认为56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇等均可有效灭活SARS-CoV-2[5-6]。根据《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》[7]，感染性材料或活病毒应在采用可靠的方法灭活后在生物安全二级实验室进行核酸检测，但是指南对具体灭活方法并没有进行明确规定。目前，SARS-CoV-2核酸检测假阴性率过高，灭活对病毒检出率的影响不容忽视。

1 材料与方法

1.1标本来源 选取本院SARS-CoV-2核酸检测结果为阳性的18份未灭活咽拭子标本为研究对象。

1.2仪器与试剂 数显电热恒温水浴锅(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)、干浴锅(上海蓝豹实验仪器有限公司)、全自动核酸提取仪(江苏硕世科技股份有限公司)、LightCycle 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)。SARS-CoV-2核酸检测试剂盒(双重荧光PCR法，上海之江生物科技股份有限公司，批号：20200303)。

1.3方法

1.3.1标本处理 将所有标本均匀分成7份，每份体积为250 μL；分别采用56 ℃金属浴30 min、56 ℃金属浴60 min、56 ℃水浴30 min、56 ℃水浴60 min、化学裂解15 min、化学裂解30 min 6种方法进行标本前处理；每份标本均设置对照(不做任何处理)。

1.3.2核酸检测 采用全自动核酸提取仪进行核酸提取。按照SARS-CoV-2核酸检测试剂盒说明书配制好核酸检测体系，加样后置于LightCycle 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪上，45 ℃、10 min，95 ℃、15 s，58 ℃、30 s，循环40次。在58 ℃进行单点荧光检测，荧光通道选择FAM、HEX/VIC/JOE和CY5通道，分别检测ORF1ab基因、N基因和内源性基因MNBH，内源性基因为参照基因。此次实验中各反应孔内源性基因Ct值均符合试剂盒说明书判定要求，因此其Ct值不在文中具体列出。

1.3.3结果判定 靶标检测结果判定标准：扩增曲线不呈S型，Ct值>39.00或Ct值空白为阴性；扩增曲线呈S型，且Ct值≤39.00为阳性。SARS-CoV-2核酸检测阳性结果判定标准：需满足以下2个条件中的任意1个，(1)同一份标本中SARS-CoV-2 2个靶标(ORF1ab、N基因)实时荧光定量PCR检测结果均为阳性；如果出现单靶标阳性的检测结果，则需重新采样、重新检测，如果仍为单靶标阳性，判定为阳性。(2)两种类型标本实时荧光定量PCR检测结果同时出现单靶标阳性，或同种类型标本两次采样检测中均出现单靶标阳性的检测结果，可判定为阳性[7]。

1.4统计学处理 采用SPSS21.0软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示；不符合正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同标本前处理方法下ORF1ab基因检测结果 不进行标本前处理时ORF1ab基因检出率为100.00%。经56 ℃水浴30 min、56 ℃水浴60 min处理后，ORF1ab基因检出率分别为94.44%、100.00%。经56 ℃水浴30 min处理与不处理检测值的差值为1.13(-0.37,2.55)，经56 ℃水浴60 min处理与不处理检测值的差值为0.25(-1.81,0.79)。经化学裂解15 min、化学裂解30 min处理后，ORF1ab基因检出率分别为77.78%、50.00%。经化学裂解15 min处理与不处理检测值的差值为2.94(2.43,4.17)，经化学裂解30 min处理与不处理检测值的差值为4.30(3.55,5.52)。经56 ℃金属浴30 min、56 ℃金属浴60 min处理后，ORF1ab基因检出率分别为83.33%、77.78%。经56 ℃金属浴30 min处理与不处理检测值的差值为2.01(0.43,4.80)，经56 ℃金属浴60 min处理与不处理检测值的差值为1.75(-0.44,4.20)。不同标本前处理方法与不处理检测值的差值之间差异有统计学意义(H=39.26，P<0.05)。见表1。

表1 不同标本前处理方法下ORF1ab基因检测结果

2.2不同标本前处理方法下N基因检测结果 不进行标本前处理时N基因检出率为100.00%。经56 ℃水浴30 min、56 ℃水浴60 min处理后，N基因检出率均为100.00%。经56 ℃水浴30 min处理与不处理检测值的差值为0.80(-0.01,2.71)，经56 ℃水浴60 min处理与不处理检测值的差值为0.39(-1.10,0.80)。经化学裂解15 min、化学裂解30 min处理后，N基因检出率分别为77.78%、61.11%。经化学裂解15 min处理与不处理检测值的差值为2.63(0.83,3.36)，经化学裂解30 min处理与不处理检测值的差值为4.40(3.19，6.23)。经56 ℃金属浴30 min、56 ℃金属浴60 min处理后，N基因检出率分别为88.89%、77.78%。经56 ℃金属浴30 min处理与不处理检测值的差值为2.09(-0.09,3.42)，经56 ℃金属浴60 min处理与不处理检测值的差值为0.63(-1.83,6.59)。不同标本前处理方法与不处理检测值的差值之间差异有统计学意义(H=27.32，P<0.05)。见表2。

表2 不同标本前处理方法下N基因检测结果

2.3不同标本前处理方法下SARS-CoV-2核酸检测结果 18份标本不进行标本前处理时双靶标检测结果均为阳性。1份标本经56 ℃水浴30 min处理后出现单靶标阳性，假阴性率为0.00%(0/18)；经56 ℃水浴60 min处理后18份标本双靶标检测结果均为阳性，假阴性率为0.00%(0/18)。经化学裂解15 min处理后出现2份标本双靶标阴性，3份标本单靶标阳性，假阴性率为11.11%(2/18)；经化学裂解30 min处理后出现7份标本双靶标阴性，2份标本单靶标阳性，假阴性率为38.89%(7/18)。经56 ℃金属浴30 min处理后出现1份标本双靶标阴性，3份标本单靶标阳性，假阴性率均为5.56%(1/18)；经56 ℃金属浴60 min处理后出现1份标本双靶标阴性，6份标本单靶标阳性，假阴性率为5.56%(1/18)。见表3。

表3 不同标本前处理方法下SARS-CoV-2核酸检测结果(ORF1ab基因/N基因)

3 讨 论

由于SARS-CoV-2传染性强，因此在进行标本核酸提取前需进行灭活处理，但是灭活过程可能会造成病毒核酸降解，从而导致检测结果出现假阴性[8]。

本研究中，ORF1ab与N基因经56 ℃水浴30 min处理与不处理检测值的差值,经56 ℃水浴60 min处理与不处理检测值的差值均较低，且假阴性率均为0.00%，说明经56 ℃水浴处理后标本检测值最接近不处理时的检测值，且对SARS-CoV-2核酸检测结果的判定影响最小。本研究中56 ℃水浴60 min对检测值的影响小于56 ℃水浴30 min，考虑可能与以下因素有关：将大批量标本放置于水浴锅中加热时，水浴时间太短会导致标本内部温度不均匀，可能会影响病毒核酸的提取和PCR扩增[8],而延长水浴时间至60 min则可使标本受热更均匀，温度更接近或达到56 ℃。但有研究使用56 ℃水浴30 min处理咽拭子标本，发现该处理方法对SARS-CoV-2核酸检测结果无明显影响[9]，但是该研究所检测的阳性标本ORF1ab和N基因的Ct值为19～30，未能覆盖病毒含量较低的标本，而本研究中阳性标本ORF1ab和N基因的Ct值为21.47～36.95，提示该结论同样适用低病毒含量的标本。本研究56 ℃金属浴30 min、56 ℃金属浴60 min、化学裂解15 min、化学裂解30 min这4种标本前处理方法均出现了假阴性结果。56 ℃金属浴处理后标本ORF1ab、N基因检测值较不处理时有明显变化，ORF1ab、N基因的检出率也均低于不处理时的检出率。该结果与华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科所得出的56 ℃金属浴60 min灭活不影响呼吸道标本SARS-CoV-2核酸检测结果的结论不一致[10]。对于56 ℃金属浴和56 ℃水浴处理后结果不同的现象，考虑可能与升温介质和升温速度不同有关[9]，具体原因目前尚未得到实验验证。而经化学裂解处理后标本检测值较不处理时的检测值有较大变化，且假阴性率高，其原因可能是标本经长时间裂解后，释放的SARS-CoV-2核酸被RNA酶降解。

综上所述，SARS-CoV-2核酸检测的标本前处理方法应首选56 ℃水浴60 min和56 ℃水浴30 min，即使在病毒含量较低的标本中，经过该方法处理，病毒核酸依然能被检出。而化学裂解法对标本核酸检测结果影响最大，容易出现假阴性结果，不建议在日常实验中使用。为减少标本前处理过程中可能导致的实验室感染，应选择水浴锅这类稳定的加热装置让标本均匀受热，通过分散放置标本或适当延长加热时间等措施使标本温度达到56 ℃，确保SARS-CoV-2灭活达到实验室安全要求。