γ射线对Beagle犬肠道组织及粪便菌群的影响

许文黎,李曙芳,王新钢,王远飞,王永丽,胡波,李建国

(中国辐射防护研究院GLP中心；山西 太原，030006)

电离辐射在核医学、食品辐照灭菌等方面具有广泛应用，由此产生的电离辐射损伤逐渐成为一项重大的公共卫生问题。电离辐射损伤涉及造血、免疫、胃肠道、皮肤、晶体和中枢神经系统等各个方面，其中肠道组织自我更新较快，对电离辐射十分敏感，是电离辐射损伤的重要靶组织。本研究采用16srDNA技术，分析60Co γ射线不同剂量全身照射对Beagle犬的肠道组织及粪便菌群的影响。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

雄性健康Beagle 犬，体重7.5～8.0 kg，6～9月龄，南京柴门生物科技有限公司[许可证号：SCXK(苏)2016—0007]。动物购回后，饲养于中国辐射防护研究院GLP中心[许可证号：SYXX(晋)2018—0005]。

1.2 动物分组与照射

钴源，中国辐射防护研究院，钴源标定证书编号：Dyjl2013-3512，标定单位中国计量科学研究院，标定时间2013年10月。

按体重将Beagle犬随机分为空白对照组(不予照射)，2 Gy、3 Gy和 4 Gy 照射组，每组4只。60Co γ射线单次全身照射，剂量率50 cGy/min，源距为2.49 m。

1.3 观察指标

1.3.1一般体征

每天观察记录动物的临床表现，主要包括精神状态、食欲、粪便、呕吐情况等，记录各组动物的存活时间，每周测量体温、体重。

1.3.2肠道病理

动物处死后，取部分肠道组织，经10%福尔马林固定、脱水、包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色后，光学显微镜下观察肠道的病理学改变。

1.3.316srDNA测序与生物学分析

在照射后第14天取动物新鲜粪便冻存于2 mL无菌冻存管中，置于-80 ℃保存；将所取粪便标本送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行16srDNA测序。

基于Silva132数据库，将序列聚类成为OUTs，使用R软件(Version2.15.3)、Qiime软件(Version9.1)和LEFSe软件进行α多样性分析、β多样性分析、门和属水平的物种相对丰度及LEFSe分析。α多样性分析采用Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数，其中Chao1指数和ACE反映物种的丰富度，Shannon指数和Simpson指数反映物种的多样性和均匀性，Shannon指数越大、Simpson 指数越小，说明样本中的物种多样性越大；β多样性分析采用主坐标分析，如果样本距离越接近表示物种组成结构越相似。

1.4 统计学处理

使用Qiime软件计算chao1、shannon、simpson、ACE指数，使用R软件采用进行α多样性组间差异分析，其中只有2个分组时进行t检验和wilcox秩和检验，分组大于2时进行wilcox秩和检验和Tukey检验。p<0.05为差异有统计学意义。

LEFSe分析使用LEFSe软件，默认设置LDA Score的筛选值为4。

2 结果

2.1 一般症状

2 Gy照射组：所有动物在照射后均未见明显异常。

3 Gy照射组：在照射后15天发现1只动物出现精神萎靡、食欲减退的现象，持续2天后精神状态恢复，但仍见便血；照射后20天发现第2只动物出现轻微的食欲减退现象。

4 Gy 照射组：照射后20 h 有1只的盘内有粘稠状呕吐物，1只出现恶心反胃的表现；照射后7 d发现1 只动物出现稀便现象；照射后10 d和11 d 所有动物均出现流涎现象和胃肠道症状，主要表现为食欲减退；死亡动物在死亡前1 天均出现柏油便。于照射后 15、18、28 天各死亡1只，生存时间为 18.5 天。

体重：照射前各组动物体重均衡，照后各时间点各组动物体重差异不显著。

体温：照后第14 d，4 Gy照射组动物的体温与对照组相比有所升高，与照射前相比亦有所升高，且差异显著。

2.2 肠道组织病理

2 Gy 照射组：肠粘膜上皮细胞出现少量变性。

3 Gy 照射组：肠粘膜上皮细胞数量有所减少，出现变性细胞。

4 Gy 照射组：肠粘膜上皮细胞数量明显减少，出现变性细胞，细胞大小不均一，随照射剂量的增加，症状逐渐严重。3只死亡动物解剖可见肠系膜、直肠局部出血等症状。

2.3 OTU聚类与统计

对Beagle犬粪便样品进行测序，以97%的一致性将序列聚类成OTUs，共得到592个OTUs，将OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释，共587(99.16%)个OTU注释到门水平，576(97.3%)个OTU注释到纲水平，568(95.95%)个OTU注释到目水平，547(92.40%)个OTU注释到科水平，418(70.61%)个OUT注释到属水平，140(23.65%)个注释到种水平。由图1Rank-Abundance曲线可见，随着OUT的递增，曲线趋于平坦，表明测序深度已经基本覆盖样品中所有的物种。

图1 等级聚类曲线

2.4 菌群多样性分析

Beagle犬粪便肠道菌群α多样性分析指数列于表1。由表1可见，4 Gy照射组的Shannon指数显著低于空白对照组，Simpson指数显著高于空白对照组；结果说明照射后Beagle犬的肠道菌群α多样性呈下降趋势，物种的丰富度无明显变化。

表1 Beagle犬粪便肠道菌群α多样性分析指数

图2为β多样性分析结果。由图2可见，空白对照组的组内样本与照射组的组内样本距离较远，说明空白对照组与照射组之间的β多样性存在差异。

图2 Beagle犬粪便肠道菌群β多样性分析结果

2.5 粪便菌群门水平构成分析

空白对照组：粪便菌群主要有厚壁菌门和放线菌门组成，相对丰度的平均值分别为 93.2%和 4.3%。

2 Gy 照射组：粪便菌群主要有厚壁菌门和变形菌门组成，相对丰度的平均值分别为 94.2%和 4.1%，放线菌门下降到 0.7%。

3 Gy 照射组：粪便菌群主要有厚壁菌门、变形菌门和放线菌门组成，相对丰度的平均值分别为 83.6%、13.1%和 2.4%。

4 Gy 照射组：粪便菌群主要有厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和梭杆菌门组成，相对丰度的平均值分别为 92.8%、3.4%、1.3%和 2.1%。

分析结果表明，照射后厚壁菌门和放线菌门均减少，变形菌门增加。

2.6 粪便菌群门水平构成分析

空白对照组：粪便菌群均主要有乳杆菌属、艰难梭菌属、苏黎世杆菌属、布劳特氏菌属和霍尔德曼氏菌属组成，相对丰度的平均值分别为36.0%、7.0%、18.6%、5.3%和 12.5%。

2 Gy 照射组：粪便菌群均主要有乳杆菌属、链球菌属、艰难梭菌属、苏黎世杆菌属、布劳特氏菌属和霍尔德曼氏菌属组成，相对丰度的平均值分别为 47.3%、16.2%、11.8%、2.2%、3.2%和 0.7%。

3 Gy 照射组：粪便菌群均主要有乳杆菌属、艰难梭菌属、苏黎世杆菌属、布劳特氏菌属和霍尔德曼氏菌属组成，相对丰度的平均值分别为 50.3%、9.7%、2.3%、3.7%和 1.0%。

4 Gy 照射组：粪便菌群均主要有乳杆菌属、艰难梭菌属、苏黎世杆菌属和霍尔德曼氏菌属组成，相对丰度的平均值分别为53.0%、7.3%和 6.3%。

分析结果表明，照射后艰难梭菌属增多，苏黎世杆菌属、布劳特氏菌属和霍尔德曼氏菌属减少。

2.7 LDA effect size(LEFSe)分析

通过LEFse 分析，能够展示空白对照组与 2 Gy、3 Gy、4 Gy 剂量照射组具有统计学意义的标志性菌群，找出照射不同剂量是发生改变的菌群。空白对照组以厚壁菌门、八叠球菌、艰难梭菌属为优势菌；2 Gy照射组以变形菌纲、变形菌门、链球菌目、链球菌科为优势菌；4 Gy照射组以加氏乳杆菌、丹毒丝菌纲、丹毒丝菌目、丹毒丝菌科、罗伊氏乳杆菌、变形菌纲、变形菌门、杆菌门为优势菌。

3 讨论

肠道组织病理学检查发现照射后肠道上皮细胞出现凋亡，细胞排列紊乱，出现水肿等现象，且随着照射剂量的增加，症状逐渐严重，这可能与照射后14 d导致照射组Beagle 犬逐步出现食欲减退、呕吐、稀便等现象有关。

肠道菌群作为寄居在生物肠道内的微生物群落，对生物的生长、发育、营养代谢、免疫稳态等起到重要作用[1-2]。肠道菌群通过在肠道内形成动态平衡的生态系统来维持屏障的稳态、调控机体的代谢[3]。小肠上皮细胞由于对电离辐射的高度敏感性，可诱导小肠隐窝细胞凋亡，破坏肠道屏障及菌群的组成[4]，导致致病菌激活肠道免疫系统从而引发肠道炎症[5-6]，影响先天与后天的免疫系统[7-8]，这是肿瘤患者在接受放射治疗过程中主要的损伤点，特别是胃肠道伤害，成为亟待解决的问题[9-10]。

研究发现，照射能够导致Beagle犬的肠道菌群的α多样性下降，这种改变不利于Beagle犬肠道菌群的生态平衡维持，可能直接或间接导致或加重肠道的放射性损伤。肠道菌群结构的改变，并且降低肠道菌群的多样性，改变肠道菌群的结构，这与文献报道的肠道微生物群变化的结果相吻合[11-13]。

变形菌门中包含众多致病菌，在正常健康动物体内的含量较低[14-15]。但是，对本实验的结果分析发现，照射后Beagle 犬分辨的变形菌门是空白对照组的3.4～13.1 倍，呈显著增加趋势；另外，分类下的大肠杆菌等有明显增加。这些细菌多为革兰氏阴性菌，能够产生脂多糖。而脂多糖是内毒素和重要群特异性抗原，当细菌死亡是它能够通过溶解、破坏细胞等发挥其毒性作用。艰难梭菌属于格兰氏阳性菌，可产生肠毒素和细胞毒素，使肠壁发生炎症反应，损伤肠壁细胞，使肠壁通透性增加，从而导致肠壁坏死或假膜形成。因此，这些细菌在照射后的Beagle 犬肠道内进行过度增殖，可能造成肠粘膜炎症加重，导致肠粘膜上皮细胞水肿、凋亡，造成肠粘膜破坏。临床研究结果显示，放射性肠炎患者的肠道菌群相比较无放射性肠炎的患者均有更高比例的紊乱，提示照射所引起的肠道反应与炎症性肠病之间可能存在一定的相似性，具有相同的临床症状，主要表现为腹泻、肠道出血、吸收不良等，发病机制相似。肠道内的细菌代谢物或细菌本身通过免疫应答系统能够激活T淋巴细胞，使其迁移至肠粘膜，或通过肠粘膜屏障进入体循环，从而引起一系列的免疫反应[16]。肠粘膜作为肠道的屏障系统，能够维持肠道和机体的炎症因子水平、细菌水平等。当肠粘膜发生破坏，稳态失衡，肠道内微生物菌群结构的变化和位移，可能会导致肠粘膜自身修复受阻，从而导致照射后出现肠道相关疾病。粪球菌和霍尔德曼氏菌属的比例增加，可能是由于肠道损伤后机体自身的应激反应导致的。

4 小结

60Co γ射线全身照射Beagle犬，可导致Beagle犬肠道菌群的多样性下降，造成致病菌的过度繁殖，虽然未成为肠道粪便中的优势菌群，但相对比例增加，可能导致或加重照射后的肠道损伤。