直线加速器单次照射对卡培他滨体内代谢过程的影响

王若琪,李建华,王志鹏,刘欢,张国良,高洁

(1.中国辐射防护研究院GLP中心，太原，030006；2.山西白求恩医院肿瘤中心，太原，030032)

本实验利用医用直线加速器单次照射SD大鼠，模拟临床肿瘤患者放疗损伤。通过药代动力学手段研究放疗对卡培他滨体内过程的影响，为临床探索对正常组织毒性较小而治疗窗增宽的治疗方案提供参考依据，阐明放化疗联合治疗中放疗与化疗间的相互作用，为肿瘤治疗研究提供新的思路。

1 实验材料

1.1 实验动物

SD大鼠12只，雄性，体重为(250±20)g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK-(京)2016-0011。

1.2 主要仪器

UPLC1690超高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；QTRAP3200质谱仪，AB Sciex公司；QUINTIX35-1CN电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司；GL21MC高速离心机，长沙英泰仪器有限公司；MixMax涡旋混合器，美国ABSON公司；HealForce Smart-mini超纯水机，香港力康生物医疗科技控股集团；synergy医用电子直线加速器，英国Elekta公司，检定单位为河北嘉盛剂量有限公司，有效期至2022年5月。

1.3 主要试剂

卡培他滨片、希罗达，上海罗氏制药有限公司；卡培他滨、5-氟尿嘧啶对照品，中国食品药品检定研究院；甲醇，质谱级，美国Fisher公司。

2 实验方法

2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(3.0×50 mm 1.7 μm)；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0～15 min，95%→ 10%A；15～18 min，10%A；18～19 min，10%→ 95%A；19～21 min，95%A；柱温30 ℃；流速0.2 mL/min；进样体积3 μL。

2.2 质谱条件

质谱配有电喷雾离子源(ESI-)，质谱检测参数：ESI-扫描，离子源温度550 ℃，离子喷射电压为-4500 V；气帘气体(Cur)为30 p.s.i，碰撞气(CAD)为9 p.s.i，多反应检测模式(MRM)，卡培他滨监测离子对(m/z)358.2→153.9，5-氟尿嘧啶监测离子对(m/z)129.1→42.1。

2.3 对照品溶液的配制

取卡培他滨、5-氟尿嘧啶对照品各约100 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，加二甲基亚砜2 mL，振摇使溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度约为2.0 mg/mL的储备液，4 ℃避光保存。精密量取储备液适量，用甲醇逐级稀释，配制浓度为200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、10.0、5.0、2.5和1.0 μg/mL的系列混标溶液。

2.4 血浆样本的制备

分别取200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、10.0、5.0、2.5和1.0 μg/mL的系列混标溶液各20 μL，分别加到180 μL空白血浆中，配制终浓度为20 000、10 000、5 000、2 500、1 250、1 000、500、250和100 ng/mL的系列血浆标准样本，储存于-20 ℃冰箱。

2.5 样本处理方法

取大鼠血浆200 μL，加入甲醇600 μL，涡旋3 min，混合均匀；4 ℃，13 000 rpm，离心20 min后，取上清10 μL，加入超纯水90 μL，0.22 μm滤膜过滤。

2.6 提取回收率试验

取大鼠空白血浆180 μL三份，配制低、中、高三个浓度(10 000，1 250，250 ng/mL)样品，每一浓度进行6样本分析，得血浆样品中卡培他滨、5-氟尿嘧啶的峰面积。

另取空白血浆180 μL三份，按2.5“样本处理方法”项下操作至“13 000 rpm，离心20 min”，取上清，分别加入卡培他滨、5-氟尿嘧啶标准溶液(100.0、12.5、2.5 μg/mL)20 μL，涡旋混匀，取10 μL，加入超纯水90 μL，0.22 μm滤膜过滤，制成低、中、高三个浓度(10 000，1 250，250 ng/mL)的样品，每一浓度进行3样本分析，记录色谱图，得卡培他滨、5-氟尿嘧啶的峰面积，取平均值。以每一浓度两种处理方法峰面积之比计算提取回收率。

2.7 医用电子直线加速器单次照射大鼠损伤模型建立

SD大鼠10%水合氯醛麻醉并固定，X射线模拟机进行定位，照射部位为剑突与后肢之间，身体其他部位用铝板遮蔽。直线加速器6 MeV电子线照射，剂量率3 Gy/min，单次照射10 Gy。

2.8 在体肠单向灌流

实验前大鼠禁食12小时，正常饮水，麻醉并固定，沿腹中线打开腹腔约3 cm，对需要考察的肠段于两端剪切后插管，将灌注管和引流管分别插入十二指肠、小肠、结肠等不同部位的近端和远端，结扎。

手术完成后，将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿，保温。先用37 ℃生理盐水将肠内容物冲洗干净，稳定后泵入空气，将肠道内剩余液体排尽。蠕动泵将含有所研究药物的溶液以一定的速度灌入肠腔，收集流出液，LC-MS检测流入与流出液中卡培他滨浓度。

实验结束后，将大鼠处死，轻柔的将被考察的肠段剪下，在37 ℃生理盐水浸润下剪开肠段，用手术丝线附着法测量其长度(l)和内半径(r)，重量法计算药物吸收速率常数(Ka)和药物表观吸收系数(Papp)。

3 结果

3.1 大鼠单次照射腹腔损伤模型

大鼠腹腔单次照射后6～8天，与对照组比较，照射组均观察到摄食、饮水量减少，体重降低，蜷缩少动，粪便稀软甚至血便。分别取对照组和照射组肠组织制片病理观察，与对照组比较，照射组表现为固有层腺体轮廓欠完整，结构紊乱，排列稀疏，黏膜下炎细胞浸润，多灶溃疡形成。

3.2 色谱-质谱方法学验证

3.2.1专属性

5-氟尿嘧啶的保留时间为1.947 min，卡培他滨的保留时间为19.025 min，空白血浆中的内源性物质和代谢物不干扰5-氟尿嘧啶和卡培他滨的测定，方法的专属性良好。

3.2.2标准曲线和线性范围

以待测物浓度(ng/mL)为横坐标(X)，待测物峰面积为纵坐标(Y)，用加权最小二乘法进行线性回归运算，求得卡培他滨标准曲线：Y=0.853X-51.58(R2=0.990)，5-氟尿嘧啶标准曲线：Y=2.41X+683.5(R2=0.993)，结果表明，卡培他滨和5-氟尿嘧啶在100～20 000 ng/mL范围内浓度与峰面积的线性关系良好。

3.2.3定量下限、准确度和精密度

按信噪比S/N≈10确立定量限，测得血浆中卡培他滨、5-氟尿嘧啶的定量下限均为100 ng/mL，RSD值分别为16.8%和17.9%。卡培他滨、5-氟尿嘧啶的血浆样本批间准确度和精密度良好，均可满足实验要求。

3.2.4提取回收率

卡培他滨和5-氟尿嘧啶提取回收率结果见表1。由表1可见，卡培他滨、5-氟尿嘧啶血浆样品的平均提取回收率分别为82.5%和94.9%，均可满足实验要求。

表1 卡培他滨和5-氟尿嘧啶提取回收率

3.3 血药浓度-时间曲线

对照组与照射组大鼠分别单次灌胃500 mg/kg卡培他滨后血药浓度-时间关系见图1。

图1 大鼠单次灌胃500 mg/kg卡培他滨后卡培他滨及5-氟尿嘧啶平均血药浓度-时间曲线

经WinNonlin软件处理后，采用非房室模型求算大鼠血浆中卡培他滨及5-氟尿嘧啶的药代动力学参数，包括半衰期(t1/2)、清除率(ClF)、表换分布容积(VzF)、从给药时间开始到最后一个点时间的药时曲线下面积(AUClast)、从给药时间开始到理论外推无穷远的药时曲线下面积(AUCINF)、达峰时间(Tmax)、达峰浓度(Cmax)等，结果列于表2。

表2 卡培他滨和5-氟尿嘧啶药动学参数

结果可见，与对照组相比，单次灌胃给药后，照射组卡培他滨和5-氟尿嘧啶均出现血药浓度降低，Tmax延迟，Cmax降低，清除率加快，表观分布容积略有增加，但两组间消除t1/2未见显著差异，说明直线加速器腹部局部10 Gy单次照射能抑制卡培他滨在肠道吸收进入血液循环，达峰时间推迟，峰浓度和血药浓度降低，同时排泄加快；然而没有影响卡培他滨的代谢速率。

3.4 在体肠单向灌流卡培他滨肠吸收情况

Pin/Pout分别为进口处和出口处灌流液中药物的质量浓度，分别比较十二指肠、小肠和结肠中卡培他滨吸收速率常数(Ka)和表观吸收系数(Papp)，参数列于表3。结果表明，10 Gy单次照射后，照射组小肠和结肠部分的Ka和Papp均低于对照组。

表3 卡培他滨肠灌流吸收速率常数和表观吸收系数

4 讨论

本实验所建立的UPLC-MS/MS分析方法操作简单、可重复性高，能同时测定大鼠血浆样品中原型药物卡培他滨及活性代谢物5-氟尿嘧啶。

大鼠10 Gy单次照射，肠组织病理表现为固有层腺体轮廓欠完整，结构紊乱，排列稀疏，黏膜下炎细胞浸润，多灶溃疡形成。腹部放疗直接破坏肠道组织DNA双链，或者产生氧自由基，间接破坏DNA结构，阻断DNA转录和复制过程，造成腹盆腔放射性损伤，特别是放射性肠粘膜损伤，主要表型为炎症、溃疡等[1-3]。

卡培他滨在肠道透膜吸收，同时代谢生成5-氟尿嘧啶，从本试验结果可知，直线加速器腹部局部10 Gy单次照射可抑制卡培他滨在肠道吸收进入血液循环，使大鼠体内卡培他滨的清除率增加、血药浓度降低、Cmax降低。此外，放疗损伤肠道机械屏障、免疫屏障、化学屏障及生物屏障，引起肠道病态条件下结构/功能(肠粘膜损伤、肠通透性增加、肠道菌群失调等)的改变，以结肠、小肠最为敏感[4-6]。在体肠单向灌流显示，10 Gy单次照射导致结肠、小肠部位的Ka和Papp显著降低，这也与文献报道一致。研究认为患者放疗引起的肠道损伤影响卡培他滨在肠道组织的吸收，改变体内过程，可能是增加其毒副作用的机制之一。

5 结语

辐射能导致机体产生炎症、溃疡等反应，损伤肠道的机械屏障、免疫屏障、化学屏障及生物屏障，同时也能导致药物在机体的代谢动力学特征发生显著改变。临床开展放疗和化疗联合治疗时，应注意放疗引起的组织损伤等毒副作用，同时关注机体对药物的代谢变化，并据此合理设计给药方案，以尽可能降低放疗引起的照射不良反应[7-11]。