低聚壳聚糖对小鼠的辐射损伤防护作用探讨

郭剑平,张华屏,周朝东,杨仲田

(1.中国辐射防护研究院GLP中心，太原，030006；2.山西医科大学，太原,030001；3.中国辐射防护研究院, 太原，030006)

壳聚糖是自然界广泛存在的甲壳素经脱乙酰化得到的产物，是天然多糖中唯一的碱性多糖。小于20个单糖的壳聚糖称为低聚壳聚糖。有研究表明低聚壳聚糖具有抗辐射损伤作用[1-2]，并且毒性极低。本文从组织、细胞、蛋白和基因表达水平探讨低聚壳聚糖的辐射损伤防护效果及机理，为筛选高效、低毒的辐射防护药物提供参考依据。

1 实验材料

1.1 低聚壳聚糖

以食品级大分子壳聚糖为原料，敏化剂协同作用，经辐照降解氧化后制备而成。分子量<2 kD，分散系数1.21。使用前用蒸馏水配制成溶液。

1.2 实验动物

6周雄性清洁级SX1近交系小鼠，山西省肿瘤研究所动物实验室提供，许可证号：SCXK(晋)2007-001。

1.3 辐照源

60Co γ源，活度1.2×1015Bq，中国辐射防护研究院钴源房。

1.4 主要仪器和试剂

1.4.1仪器

BD FACSAria型流式细胞仪，贝克曼公司；转印槽/伯乐转膜仪，BIO-RAD，Trana-Blot；化学发光检测系统试剂，BIO-RAD；化学发光荧光成像系统，Chemi Doc XRS。

1.4.2试剂

凋亡试剂盒(Annexin V-FITC)，凯基公司，国产；beta-actin抗体，sc-47778，Santa Cruz Biotechnology；P53抗体:sc-73566，Santa Cruz Biotechnology。

2 实验内容和方法

2.1 小鼠30天存活率

实验小鼠按给药浓度随机分5组，每组10只，口服灌胃，给药剂量为0(单纯照射组)、200、300、400和500 mg/kg，每天给药1次，连续14天，给药第7天对小鼠进行全身照射，吸收剂量7 Gy，剂量率70 cGy/min。观察不同处理组30天小鼠存活情况，统计30天存活率、平均存活天数，计算保护指数[3]。

保护指数≥1.2为有保护作用。

2.2 骨髓有核细胞数

实验小鼠随机分为正常对照组、单纯照射组、低聚壳聚糖组(300 mg/kg)，每组10只。连续灌服低聚壳聚糖21天，每天1次。正常对照组和单纯照射组灌服蒸馏水。给药第7天后两组小鼠均接受3.5 Gy60Co γ射线全身照射，剂量率0.5 Gy/min。照射后第14天取小鼠股骨，用1 mL白细胞稀释液冲出骨髓液，并调整细胞浓度，用细胞计数板在显微镜下计数骨髓有核细胞数。

2.3 骨髓细胞凋亡

实验小鼠随机分为正常对照组、单纯照射组、低聚壳聚糖组(300 mg/kg)，每组6只。给药第14天后两组小鼠接受5 Gy60Co γ射线全身照射，剂量率0.5 Gy/min。

照射后6、12、24和48 h取出两大腿股骨，用PBS液冲出骨髓细胞，混匀。处理并调整细胞浓度为105/mL，按试剂盒说明方法染色，用流式细胞仪检测凋亡细胞率[4]。

2.4 脾脏器系数

实验小鼠随机分为正常对照组、单纯照射组、低聚壳聚糖组(300 mg/kg)3个实验组，每组40只。连续灌服低聚壳聚糖14天，每天1次。正常对照组和单纯照射组灌服蒸馏水。给药第14天后两组小鼠均接受7 Gy60Co γ射线全身照射，剂量率0.33 Gy/min。在照后第5、10、15、20、30天，各组分别取5只存活小鼠脾脏，称取并记录脾脏重量。

2.5 细胞凋亡相关基因表达变化

实验小鼠随机分为正常对照组、单纯照射组、低聚壳聚糖组(300 mg/kg)3个实验组，每组10只。给药第14天后两组小鼠接受5 Gy60Co γ射线全身照射，剂量率0.5 Gy/min。

照射后6 h，摘取动物脾脏，每个脾组织分别进行RT-PCR方法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3，以GAPDH为参照，Photoshop 7.0分析条带。各基因RT-PCR试验条件见表1。

表1 各基因RT-PCR试验条件一览表

2.6 细胞P53蛋白质、Gadd45蛋白质

实验小鼠随机分为正常对照组、单纯照射组、低聚壳聚糖组(300 mg/kg)，每组10只。给药第14天后两组小鼠接受5 Gy60Co γ射线全身照射，剂量率0.5 Gy/min。照射后6 h，摘取动物脾脏，用Western blot方法检测P53蛋白质和Gadd45蛋白质。

2.7 统计分析

用卡方检验对30天存活率进行检验，用t检验对两样本均数差别的显著性进行检验。

3 结果和讨论

3.1 结果

3.1.130天存活率

不同浓度低聚壳聚糖对受照小鼠30天存活率、平均存活时间和保护指数的影响检测结果列于表2。

表2 不同浓度低聚壳聚糖对受照小鼠30天存活率、存活天数、保护指数的影响

由表2可见，与单纯照射组相比，各低聚壳聚糖组(200～500 mg/kg)的小鼠30天存活率分别提高20%、30%、20%和10%，平均存活时间差异显著，其中300 mg/kg组在各组中的30天存活率、平均存活天数和保护指数最高(保护指数≥1.2为有效)。故后期试验采用的药物浓度均为300 mg/kg(称为“低聚壳聚糖组”)。

3.1.2有核细胞数和骨髓细胞凋亡

低聚壳聚糖对受照小鼠骨髓有核细胞数和骨髓细胞凋亡的影响结果列于表3和表4。由表3可见，低聚壳聚糖组骨髓有核细胞数显著高于单纯照射组。由表4可见，低聚壳聚糖组的凋亡细胞下降，6～12 h变化较大，与单纯照射组相比差异显著。

表3 低聚壳聚糖对受照小鼠骨髓有核细胞数的影响

表4 低聚壳聚糖对受照小鼠骨髓细胞凋亡的影响

3.1.3脾脏器系数

低聚壳聚糖对受照小鼠不同时间脾脏脏器系数的影响结果列于表5。由表5可见，低聚壳聚糖组照射后第5～20天，脾脏器系数值有缓慢上升趋势，与单纯照射组相比差异显著。

表5 低聚壳聚糖对受照小鼠不同时间脾脏脏器系数的影响

3.1.4脾脏凋亡基因

低聚壳聚糖对受照小鼠6 h脾脏凋亡基因的影响变化情况列于表6。由表6可见，与正常对照组相比，低聚壳聚糖组凋亡相关基因Caspas-3下调，Bax上调，Bcl-2上调，Bcl-2/Bax比值提高，比值高于1；与单纯照射组相比差异显著。

表6 低聚壳聚糖对受照小鼠6 h脾脏凋亡基因变化情况

3.1.5P53蛋白质、Gadd45蛋白质表达

图1为 Western blot方法检测P53、Gadd45蛋白结果。低聚壳聚糖对受照小鼠脾脏P53蛋白质表达水平的影响见图2(a)，对Gadd45蛋白质表达水平的影响见图2(b)。由图2可见，与单纯照射组相比，低聚壳聚糖组的蛋白质表达水平降低。

图1 Western blot方法检测 P53、Gadd45蛋白结果

图2 低聚壳聚糖对受照动物脾脏P53、Gadd45蛋白表达的影响

3.2 讨论

电离辐射能够引起机体组织器官的严重损伤，而机体的各个组织器官对辐射的敏感性是有差异性的，其中骨髓是机体重要的中枢免疫及造血器官，脾脏是机体重要免疫器官，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，同时脾脏也是机体血液储存的重要器官。

小鼠受到照射后，骨髓有核细胞数降低，但低聚壳聚糖组有核细胞数显著提高。5 Gy照射后骨髓细胞凋亡发生在6～12 h，24 h后下降，与文献报道一致[5]。与单纯照射组相比，低聚壳聚糖组6～12 h凋亡细胞发生数明显下降，表明低聚壳聚糖能够抑制辐射引起的细胞凋亡，减少由于照射造成的骨髓细胞损失，有效保护骨髓细胞的造血功能，具有一定的辐射防护作用。

低聚壳聚糖组小鼠脾脏器系数在照后20天内变化不大，到30天时，接近正常对照组。低聚壳聚糖在动物照射损伤后，调节脾脏相关凋亡基因表达，最后表现出降低脾脏脏器系数的减少，对受损动物免疫功能的恢复起到积极的作用。

细胞凋亡是影响细胞辐射敏感性的重要事件，减少细胞凋亡，保持细胞存活是辐射损伤防治的重要措施之一。P53在损伤细胞存活中起重要作用并因此被誉为“基因警察”。本实验单纯照射组P53蛋白质增加，而低聚壳聚糖组P53蛋白质表达水平降低，说明低聚壳聚糖对辐射所致的P53蛋白质表达水平有抑制作用。

P53诱导细胞凋亡的机制是通过Bax/Bcl-2这一比值的转换而完成。Bcl-2和Bax是一对关系密切的凋亡基因，在细胞凋亡调控中起重要作用。Bcl-2抑制细胞的凋亡，Bax则促进细胞的凋亡。Bcl-2/Bax比例对决定细胞命运起着关键的作用。当Bcl-2/Bax比值>1时，细胞凋亡无明显增加；而Bcl-2/Bax比值<1时，细胞凋亡增加明显。本实验中低聚壳聚糖组促凋亡基因Bax、Caspas-3表达均下调，抑制凋亡基因Bcl-2表达上调，Bcl-2/Bax比值>1，与单纯照射组相比有差异显著。表明低聚壳聚糖有抑制辐射损伤小鼠脾组织细胞凋亡的作用。研究表明，DNA损伤使P53蛋白活力上升，P53通过对Bcl-2和Bax表达的调节，降低细胞对凋亡刺激因素的耐力[6]。可见，P53能同时在mRNA水平激活Bax基因的表达和抑制bcl-2基因的表达。P53诱导凋亡可能部分通过改变细胞内Bax、Bcl-2的比例得以实现。本实验中单纯照射组结果与以上结论相同。低聚壳聚糖抑制P53蛋白表达，通过诱导凋亡，在mRNA水平激活Bcl-2基因的表达和抑制Bax基因的表达，改变细胞内Bcl-2、Bax的比例，提高细胞对凋亡刺激因素的耐力，导致凋亡细胞的减少，抑制了DNA损伤对细胞的凋亡作用。

Gadd45是一个生长阻滞和DNA损伤基因，是P53下游靶基因。Gadd45可以通过P53依赖及非依赖两条途径被诱导表达增高，参与细胞周期检查点、细胞凋亡、DNA损伤修复以及信号传导等重要细胞生命活动的调节[7-8]。在电离辐射的作用下，Gadd45可以通过P53依赖的方式表达上调。研究表明，高剂量X射线照射可引起P53蛋白增多诱导Gadd45增加[9]，本实验单纯照射组Gadd45、P53蛋白质表达水平升高，与研究结果一致。但低聚壳聚糖组Gadd45、P53蛋白质表达水平均有降低趋势。

低聚壳聚糖间接参与DNA损伤修复、细胞凋亡、细胞周期等重要细胞生命活动的积极调控，减少由于照射引起的造血细胞和免疫细胞数量损失，并维持其功能的实现，导致动物存活率的提高。低聚壳聚糖提高存活率的影响因素很多，其中抑制细胞凋亡是有效因素之一。

本研究结果证实低聚壳聚糖具有辐射损伤保护作用，它可能通过抑制P53蛋白、GADD45蛋白质水平表达，影响凋亡相关基因表达，从而抑制凋亡细胞的产生，促进骨髓和脾脏细胞数量的恢复，从而有效提高了受到致死剂量γ射线照射小鼠的30天存活率。

4 结语

核能属于清洁能源，随着人类对核能利用的日趋广泛，对辐射损伤机制和防护药物的研究逐渐成为人们关注的热点，开发高效、低毒的理想抗辐射损伤药物就变得尤为重要。氨磷汀(WR2721)作为唯一被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的辐射防护剂，可通过清除自由基、诱导细胞缺氧、保护DNA及促进DNA损伤修复等机制发挥辐射防护特性，但毒副作用较大，且临床效果不尽人意。大多数传统的辐射防护剂不良反应较大、防护时间窗较窄及给药途径受限等,临床仍缺乏理想的抗辐射药物。低聚壳聚糖来源广泛，制备技术成熟，不仅具有良好的生物降解性，还有良好的生物相容性以及生物粘附性，其降解产物无毒性，无免疫原性，可以考虑作为辐射防护剂并进行更深入的开发研究。初步证明低聚壳聚糖具有一定的辐射损伤保护作用，药物的防护作用机理研究将在今后的工作中进一步探讨。