γ射线对比格犬凝血功能的影响

李曙芳,岳娟,许文黎,黄立群,王志鹏,孙鸽,胡波

(中国辐射防护研究院GLP中心，太原，030006)

机体受到一定剂量照射后，可引起出血现象。出血是辐射损伤最严重的症状之一，也是导致机体死亡的主要原因，常表现为全身广泛性小血管出血，出血原因较为复杂，其中辐射引起凝血功能障碍和微循环障碍是引起出血的重要机制之一[1-2]。照射剂量不同，会导致出血发生时间、出血部位、严重程度不同。凝血常规检测是临床上常用的血液学检验指标之一，主要包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、D-二聚体(D-D)和纤维蛋白降解产物(FDP)等，可准确反映受检者的凝血功能状态[3]。APTT、PT分别检测内、外源性凝血系统, D-D和FDP则是纤维蛋白阶段的检测，可作为继发性纤溶亢进主要实验指标：D-D是一种纤维蛋白降解产物中的一种片段，是交联后纤维蛋白被纤溶酶降解的特异标志物，是确定体内有无血栓形成及继发性纤溶的指标，其含量变化可作为体内高凝状态和纤溶亢进的标志；FDP是在凝血过程中形成的纤维蛋白原被纤溶酶降解形成的纤维蛋白复合物，它是原发性纤溶亢进标志物。

本研究观察比格犬受到60Co γ射线不同剂量单次全身单侧照射后不同时间血小板和凝血功能指标的变化情况，以期为辐射损伤中出血综合症的研究提供基础和依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

12只健康比格犬(7.5～8.0 kg)，南京柴门生物科技有限公司[动物质量合格证号：SCXK(苏)2016-0007]。动物购回后，置于中国辐射防护研究院非啮齿类实验动物设施[合格证号：SYXX(晋)2016-0002]独居笼养。

1.2 照射条件

60Co γ射线照射源，中国辐射防护研究院钴源房，检定证书编号：DYjl2013-3512，检定单位:中国计量科学研究院，检定时间：2013年10月。

1.3 主要试剂与仪器

HEMAVET 950型全自动血细胞分析仪，美国DREW公司；半自动四通道血凝仪，法国STAGO公司；Konelab Prime30全自动生化分析仪，美国Thermo Fisher 公司；血细胞分析仪试剂包，美国DREW公司；活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)检测试剂盒为上海太阳生物技术有限公司生产；纤维蛋白原(FDP)、D-二聚体(D-D)检测试剂盒为广州科方生物技术股份有限公司生产。

1.4 实验方法

1.4.1动物分组与照射

比格犬检疫1个月后，按照体重随机分为2 Gy照射组、3 Gy照射组和4 Gy照射组，吸收剂量分别为2 Gy、3 Gy、4 Gy，每组4只。比格犬固定后，清醒状态下接受单次全身单侧照射，照射剂量率为 50 cGy/min，源距为2.50 m。

1.4.2观察指标

(1)观察动物一般体征，记录死亡时间。进行大体解剖，分析死因。

(2)血小板计数：照射前及照射后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、30 d，抽取比格犬前肢静脉血液，检测血小板计数。

(3)凝血指标：照射前及照射后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、30 d，用柠檬酸钠抗凝采血管抽取比格犬前肢静脉血2 mL，经2 500 g离心15 min分离得血浆，用于APTT、PT的检测；用分离胶-促凝剂采血管采血 5 mL，血细胞凝集后，2 500 g离心15 min，分离得血清，用于检测D-D和FDP。

1.4.3数据处理

采用SPSS 26.0统计软件，单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般体征

2 Gy照射组所有动物均未见明显异常，30天存活率为100%。

3 Gy照射组有1只动物在照射后15 d精神萎靡，食欲减退，持续2天后状态恢复，但见便血；30天存活率为100%。

4 Gy照射组照射后20 h内1只动物呕吐，1只有恶心反胃；有3只动物分别在第15、18、28天死亡，死亡动物解剖均可见肺脏大面积出血，气管内有泡沫状液体，心包、脾脏、肠系膜、直肠等局部出血。出血是动物死亡的主要原因。

2.2 血小板计数

比格犬受照后不同时间血小板计数的变化情况列于表1。由表1可见，受照比格犬在照射后7天已有出血倾向，在照射后14天达最低值，接近极期，与动物一般观察结果一致。

表1 比格犬受照后不同时间血小板计数(109/L)

2.3 凝血指标

2.3.1活化部分凝血活酶时间(APTT)

比格犬受照后不同时间APTT的变化情况列于表2。由表2可见，与照射前相比，照射组APTT从照射后24 h开始显著缩短。结果说明，受照动物的凝血机制以内源性凝血途径为主。

表2 比格犬受照后不同时间APTT的变化情况(s)

2.3.2凝血酶原时间(PT)

比格犬受照后不同时间PT的变化情况列于表3。由表3可见，与照射前相比，2 Gy照射组和3 Gy照射组PT差异不显著，4 Gy照射组照射后14 d开始显著缩短。结果说明，受照比格犬的外源性凝血机制启动较缓。

表3 比格犬受照后不同时间PT的变化情况(s)

2.3.3D-二聚体(D-D)

比格犬受照后不同时间D-D的变化情况列于表4。由表4可见，2 Gy照射组、3 Gy照射组和4 Gy照射组D-D水平分别在照后28 d、21 d和24 h显著高于照射前，受照剂量越大，D-D水平升高的时间越早，提示机体内血液呈高凝状态和继发性纤溶亢进的状况越早。

表4 比格犬受照后不同时间D-D的变化情况(mg/L)

2.3.4纤维蛋白降解产物(FDP)

比格犬受照后不同时间FDP的变化情况列于表5。由表5可见，2 Gy、3 Gy、4 Gy照射组FDP水平分别在照射后28 d、21 d和24 h显著高于照射前，受照剂量越大，FDP水平升高的时间也越早，机体原发性纤溶亢进的状况越早。

表5 比格犬受照后不同时间FDP的变化情况(μg/mL)

3 讨论

辐射引起的出血可发生在全身各部位，以点状或者斑状为主，时间以极期前最严重，程度与辐射剂量关系密切，由于具有此类特点规律，故称之为辐射出血综合征[2,4]，其发生机制大致有以下3个方面：血小板的数量和质量的异常；血凝、抗凝和纤维蛋白溶解系统障碍；血管壁的结构和功能异常。辐照可造成血小板降低，继而凝血因子被激活启动，发生一系列的瀑布反应：凝血酶原激活物形成、凝血酶原激活成凝血酶、纤维蛋白原转变成纤维蛋白等，血凝和抗凝平衡被打破，可能发生弥散性血管内凝血，最终形成血栓；同时血管壁细胞的损伤和血管脆性增加，也是机体在照后容易出血甚至致死的重要原因。

在本实验中可以看出，照射后24 h，各受照组比格犬APTT均开始下降，表明在照后早期，机体的内源性凝血机制即启动，APTT是对辐射较为敏感的指标；而血液学指标PLT在照后7天才发生明显的下降，提示出血状况可能就要发生；而D-D和FDP的变化比较一致，表明受照剂量越大，出现弥散性血管内凝血、栓塞的可能性越早，更易出现栓塞性出血疾病[5-9]。结果表明，2 Gy和4 Gy照射均可启动内源性凝血机制、形成血栓继而出现纤溶亢进，而4 Gy照射引发出血死亡的机制与血凝、抗凝和纤维蛋白溶解系统障碍有关。

因此，在今后的辐射致出血综合征机制及救治的研究中，在照后早期可关注内源性出血机制，可能发现辐射敏感标志物；极期前可关注凝血和抗凝平衡以及纤维蛋白降解，以研究具有针对性的预防措施或对症治疗措施。