溶酶体在新城疫病毒诱导肿瘤细胞凋亡和自噬中的作用

金 燕，刘开扬

溶瘤病毒疗法是治疗癌症希望的新选择。2015年10月，安进公司(Amgen)经过基因改造的HSV-1(T-VEC)被美国食品药品监督局(FDA)批准用于黑色素瘤的治疗，这是首个FDA批准的溶瘤病毒[1]。新城疫病毒是众多溶瘤病毒中的一种，具有很长的临床应用历史，与来自正在开发用于癌症治疗的不同病毒家族的重组溶瘤病毒之间有很大的相似性，大多是针对实体肿瘤的治疗。然而，针对肿瘤治疗的最佳治疗效果和特异性不明确，最终限制了恶性肿瘤的成功治疗。在过去的几十年中，溶酶体的分子调控研究迅速发展。自噬-溶酶体途径与癌症的标志密切相关，例如逃避细胞死亡途径、逃避免疫监视和降低新陈代谢[2]。因此，靶向NDV抗肿瘤细胞过程中的溶酶体具有巨大的治疗潜力，因为它不仅会触发凋亡和溶酶体细胞死亡途径，而且会抑制细胞发生保护性自噬。此外，溶酶体通过在酸性环境中隔离癌症药物而在癌症抗药性中发挥重要作用，导致药物作用减弱[3]。溶酶体可以被认为是癌细胞的致命弱点，因此，在NDV抗肿瘤过程中联合靶向溶酶体可以提高抗肿瘤的治疗效果。

1 溶酶体的结构与功能

溶酶体是一种单层囊状细胞器，目前的资料显示，对于溶酶体的命名方式根据其功能和形成过程的不同，有一种新的提法，即前溶酶体和溶酶体。溶酶体的功能为主要负责降解各种生物大分子及衰老损伤的细胞器，还参与病原体防御作用、细胞凋亡与自噬和肿瘤的发生发展等多种生物过程[4]。溶酶体与肿瘤之间的联系非常密切，通常认为的观点有：①在细胞膜受损的情况下，核膜暴露被溶酶体溶解，导致细胞突变；②肿瘤细胞大量增殖需要的某些营养物质可由溶酶体降解大分子物质产生；③许多致癌物质可以导致细胞分裂的调节机制受损，其机制可能与溶酶体释放的水解酶有关系。溶酶体内含60多种酸性水解酶，包括组织蛋白酶、核糖/脱氧核糖核酸酶、酸性磷酸酶、糖苷酶、脂肪酶、硫酸脂酶等。在众多水解酶中，组织蛋白酶与肿瘤之间的关系最为重要，并且被广泛研究，根据蛋白水解的机制不同可分为：半胱氨酸组织蛋白酶(大部分的组织蛋白酶均为此酶)、天冬氨酸组织蛋白酶(包括cathepsin D、E)和丝氨酸组织蛋白酶(包括cathepsin A、G)。各种水解酶主要在酸性环境(pH4.5)中活跃，为了保护其他细胞间室免受酶的消化，这些水解酶由空泡型H+ATPases(V-ATPases)、溶酶体相关膜蛋白1和2(lamp1，lamp2)、溶酶体整体膜蛋白2(limp2)和CD63等溶酶体膜蛋白滞留在囊泡内[5]。

2 依赖溶酶体途径的凋亡

细胞凋亡是进化高度保守的生理机制，参与消除感染、受损、衰老或不必要的细胞，在发育和控制机体内环境平稳等方面具有重要意义[6]。FAS/FASL-FADD-Caspase途径是外源性途径的代表途径。同源三聚体FasL与三分子Fas结合并使其相互交联，通过Fas上的死亡效应结构域(death effect domain，DED)募集Fas相关死亡结构域蛋白(fas-associated death domain，FADD/MORT1)，并与凋亡启始蛋白Procaspase-8结合形成所谓的死亡诱导信号复合物(death inducing signaling complex， DISC)，Procaspase-8进而活化为Caspase-8，激活下游Caspase-3等凋亡执行蛋白[7]。内源性途径(线粒体途径)主要受B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤蛋白-2(B-cell CLL/lymphoma 2, Bcl-2)家族调控，此家族是一个拥有着25种Bcl-2家族同源蛋白的家族，Bax、Bad和Bid等属于促凋亡成员；Bcl-2、Bcl-X和Bcl-W属于抑制细胞凋亡的成员。内源性途径调节细胞凋亡的主要机制与在各种刺激因子的作用下导致线粒体受损而最后发生线粒体外膜通透(mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP)有着密切联系，caspase8、caspase10 和端粒酶B等可以对底物 Bid直接切割产生tBid，诱导效应蛋白Bax和Bak在线粒体膜上聚集形成孔道，导致MOMP的发生[8]。MOMP发生后，细胞色素-C(cytochrome C，cyt-C)和Smac(second mitochondria-derived activator of caspases，Smac)从线粒体膜间隙释放到胞质中。cyt-C的释放是激活凋亡的重要角色，在dATP的存在下cyt-C通过与凋亡相关因子1(apaf1)结合形成多聚体，然后通过Caspase募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)与procaspase9结合而形成凋亡小体。凋亡小体上的procaspase9进行切割活化，促使caspase3大量活化进而诱导凋亡的发生[9]。

Wu等[10]研究发现细胞结合的cardosin A整合素可内化到溶酶体，触发溶酶体膜通透性增加，并且触发细胞凋亡级联开始，诱导细胞凋亡发生。此外，Li等[11]研究使用克罗米芬柠檬酸盐处理宫颈癌细胞hale可诱导cathepsin B和cathepsin D从溶酶体内释放到胞浆中，进而抑制细胞活力并引起细胞凋亡。这种由于主要由溶酶体膜渗透(lysosomal membrane permeabilization, LMP)引起的调节性细胞死亡被称为 “溶酶体途径的凋亡”[12-13]。活性氧物质(ROS)、鞘氨醇、Bcl-2家族等经典的刺激均可触发溶酶体膜通透性增加，从而诱导细胞发生凋亡[14-15]。除上述，LMP也可由其他刺激物诱导，包括细胞骨架破坏和溶酶体膜中鞘磷脂增加；抑制V型H+ATPase可削弱溶酶体的酸化进而导致溶酶体的失稳；在诱导成纤维细胞发生凋亡时，Bax构象发生改变后可实现从胞质转移至溶酶体膜上，诱导溶酶体膜发生通透[16]。

凋亡发生时，溶酶体膜通透在其中有着不容忽视的作用，尤其是在凋亡发生的起始时期。LMP的后果和随后细胞以何种模式死亡与溶酶体损伤的情况关系密切。一般认为强度较低的细胞应激引发的溶酶体内容物释放的剂量有限，诱导凋亡或凋亡样细胞死亡的发生；而在高强度的应激刺激下，溶酶体膜高程度的损伤和其内部酸性蛋白酶的大量释放导致细胞不受控的损害和死亡[17]。在溶酶体膜通透发生一定程度后，释放各种酸性蛋白酶到胞质中，通过对下游信号分子的剪切处理可诱导细胞凋亡，其中cathepsins是含量相对丰富及作用比较重要的一类酶。cathepsins B、D、H和L等可对Bid/Bim进行水解剪切，剪切后的产物转移至线粒体膜上，激活效应蛋白Bax/Bak。溶酶体发生LMP后除了释放组织蛋白酶，糜蛋白酶和磷脂酶类也会释放，进而诱导细胞凋亡的发生[18]。

3 溶酶体参与细胞自噬

自噬广泛地参与机体生长、发育、衰老和分化，组织器官的代谢调控，凋亡小体的清除等多种过程。起始、延伸、闭合和降解4个步骤是组成自噬过程的关键部分，简单说就是先合成并组装完成吞噬小泡，吞噬小泡在吞噬了异物之后变成了自噬体，然后装载了“货物”的自噬体与溶酶体融合，此时溶酶体内的水解酶便可以将“货物”降解。这种降解的过程需要消耗大量溶酶体，而肿瘤细胞为了维持自噬通量，需要通过溶酶体生物合成(lysosomal biogenesis)及溶酶体重塑(autophagic lysosomal reformation, ALR)等途径保障溶酶体的供给，维持溶酶体和自噬体的动态平衡，保证自噬的进行[19]。溶酶体(包括其水解酶、膜蛋白和 V-ATPase等复合体)大部分是由TFEB-coordinated lysosomal expression and regulation(CLEAR)基因网络来调控合成的，因此TFEB对于调控自噬进程中溶酶体的稳态十分重要[20]。TFEB是basic helix-loop-helix leucine zipper(bHLH-Zip)转录因子家族的一员，作为核转录因子，TFEB只有转位到细胞核并与CLEAR原件结合才能启动整个基因网络的转录[21]。TFEB在细胞内的活性与定位主要取决于它的2个丝氨酸残基Ser142和Ser211的磷酸化的状态，当Ser142和Ser211均被磷酸化时，TFEB处于失活状态并且定位于胞浆，当Ser142和Ser211被去磷酸化时，TFEB被激活并转位入核，启动溶酶体的生物合成[22]。除了调控溶酶体的生物合成之外，TFEB入核后可以起始许多自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)的转录来调控自噬的发生[23]。

mTOR通路对溶酶体稳态及自噬的调节其实也是对生长与代谢之间的调节，在调节过程中，不仅有营养因素，还有能量的因素。mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)作为一个“明星”因子，主要由mTOR、Raptor (regulatory protein associated with mTOR)和mLST8(mammalian lethal with Sec13 protein 8)等原件组成[24]。普遍认为mTORC1处于活化状态的前提是定位在溶酶体上，当活化mTORC1时，除了可以通过抑制ULK1 复合体进而抑制自噬的发生，还可以使TFEB的丝氨酸残基Ser142和Ser211磷酸化，抑制其转位入核，进而抑制溶酶体生物合成和自噬[25]；当细胞受到饥饿等刺激或在mTORC1抑制剂(如Torin1、pp242)处理时，mTORC1从溶酶体膜分离，解除对ULK1及自噬的抑制，并且引起TFEB的Ser142和Ser211去磷酸化，TFEB转位入核，诱导TFEB下游靶基因转录，增强溶酶体的数量及功能[26]。因此，自噬体形成及溶酶体的生物合成在调控自噬溶酶体形成方面起到了重要作用。

4 溶酶体在NDV诱导肿瘤细胞凋亡与自噬中的作用

新城疫病毒是一种具有高度传染性的禽类病原体，属于副粘病毒科(paramyxoviridae)副粘病毒属(avulavirus genus)，最早被发现于英国新城，因此得名。NDV粒子的直径大约为100～400 nm，其外层的包膜是由宿主细胞磷脂双分子层脂膜和病毒糖蛋白组成的双层膜结构[27]。NDV基因组为单股不分节段的负链RNA分子[ssRNA(-)]，主要编码大分子RNA聚合酶蛋白(large protein，L)，是RNA依赖性RNA聚合酶；核衣壳蛋白(nucleocapsid protein， NP)是核衣壳的主要组成成分；磷酸化蛋白(phosphoprotein，P)、基质蛋白(matrix protein，M)主要参与RNA的合成以及病毒的组装过程；血凝素—神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase protein，HN)可以与细胞上的唾液酸受体结合，促进病毒进入细胞；融合蛋白(fusion protein，F)主要参与病毒的穿入与细胞融合等过程[28]。根据禽类受感染后的致死程度，NDV毒株被分为3种致病型：速发型(高毒性)、中性毒性和低毒性(低毒力或无毒性)[29]。F蛋白裂解位点的不同是毒力强弱的主要决定因素：速发型和中胚层菌株的F切割位点具有多碱基氨基酸基序(112R/G/KR-Q/K-K/R-R↓F117)，可以被普遍存在的Furin-like蛋白酶识别和切割。相反，轻型菌株具有单碱基氨基酸(112GR/K-Q-G-R↓F117)，它们的复制周期仅限于特定组织[30]。

4.1NDV诱导细胞凋亡 NDV感染导致线粒体损伤及膜电位丧失，发生MOMP、Cyt-c释放和caspase 9活化的联级反应，这是内源性凋亡途径的3个基本要素。在NDV感染肿瘤细胞过程中，病毒进入细胞内会诱导细胞分泌Bcl-2家族蛋白，对于改变线粒体的形态结构起到非常重要的作用[31]。Molouki等[32]发现NDVAF2240毒株的M蛋白通过其BH3结构域与Bax相互作用，促进了Bax从细胞质到线粒体膜的转位，从而导致内源性凋亡途径的激活。随后在HT29、Hela和HCT116细胞中感染NDVAF2240毒株后被证实了具有同样的效果[33]。Bax可通过自身BH3结构域与该家族其他蛋白相互结合，而NDV的M蛋白含有与Bax相互作用的BH3结构域，因此在没有Bax的情况下，M蛋白能激活其他促凋亡成员[34]。Bax敲除细胞在感染病毒后死亡，可以发现NDV也能够与除Bax之外的凋亡蛋白相互作用，并检测到细胞色素c释放到胞质中，证明线粒体途径细胞凋亡可以通过直接或间接影响线粒体表面蛋白质的一些其他相互作用被激活，从而形成释放线粒体因子的孔道[32]。

4.2溶酶体参与调控NDV诱导肿瘤细胞凋亡 靶向肿瘤中的溶酶体将有巨大的治疗潜力，因为它可以触发细胞凋亡和溶酶体细胞死亡途径，也可抑制癌细胞通过自噬进行自我保护[35]。此外，溶酶体可通过其酸性环境隔离抗癌药物，导致药物作用的钝化，在癌症耐药性中发挥重要作用[36]。Song等[37]研究发现将大鼠肾小管上皮细胞暴露于铅中可以诱导溶酶体膜通透化，导致组织蛋白酶B和D释放诱导细胞发生凋亡，然后使用CA 074和Pep A抑制组织蛋白酶B和D的活性，发现凋亡现象有所减轻。这提示除了经典的死亡途径，还有可能存在其它形式的死亡通道，而由溶酶体介导的死亡通道就是其中之一。当某些凋亡因子刺激肿瘤细胞时，可增强溶酶体膜通透性和释放各种酸性水解酶进入细胞浆，然后诱导细胞死亡。组织蛋白酶的泄露除了可诱导非caspase依赖型程序性细胞死亡，还可以触发细胞线粒体途径凋亡。Granato等[38]研究发现2-苯乙炔磺酰胺(PES)可通过使溶酶体膜稳定性降低而阻碍70kD热休克蛋白(HSP70)的作用，导致细胞质中各种酸性水解酶的释放，触发线粒体途径凋亡，导致细胞死亡并抑制肿瘤生长。德国科学家使用NDV LaSota毒株感染胃癌细胞发现NDV可以诱导胃癌细胞产生肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)并与细胞表面受体结合形成复合物，肿瘤细胞中的溶酶体可摄取此复合物，然后导致溶酶体稳定性降低发生LMP，释放出各种蛋白水解酶，造成细胞内环境紊乱，诱导细胞溶解死亡[39]。

4.3NDV感染诱导自噬利于NDV的复制 近年来许多研究都集中在自噬病毒感染中有何作用。在NDV感染的癌细胞中观可以察到过度的内质网应激(ER)，通过PERK /eIF2α，IRE1 / JNK和ATF6/CHOP触发自噬。研究显示NDV的P和NP蛋白的异位表达可通过上调ER应激标记蛋白GRP78和GRP94改变了ER稳态[40]。Meng等[41]研究发现，NDV Beaudette C毒株感染人脑胶质瘤U251细胞时表现出完整的自噬通量，LC3-II在早期增加并且持续存在，p62则呈现逐渐下降的趋势。NDV La Sota株在感染人非小细胞肺癌A549细胞后依然表现出完整的自噬通量[42]。他们进一步报道，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/ Beclin-1途径在NDV诱导自噬中促进了LC3的转化和p62的降解，并促进病毒的复制[41]。尽管自噬是一种细胞防御机制，但某些病毒已经进化出使用自噬小泡进行自身复制的策略。例如，NDV感染神经胶质瘤U251细胞的过程中，将自噬相基因Atg5和Beclin-1用RNAi分别干扰分沉默后，病毒复制能力明显下降[41]。Sun等[43]利用禽源细胞DF-1和CEF作为细胞模型，发现新城疫病毒感染引发LC3-II增加，而p62减少，证实了细胞中发生了完全自噬。通过自噬阻断剂(渥曼青霉素和氯喹)药物处理抑制自噬可减少细胞中NDV的复制，再通过干扰自噬相关基因Bclin1以及敲除Atg5可能抑制NDV的复制，进一步说明自噬对NDV在细胞中复制的重要性。

4.4自噬可通过清除受损线粒体抑制凋亡 为了阐明自噬如何调节凋亡，Meng等[44]研究发现使用NDV LaSota株感染A549细胞后，受损的线粒体被溶酶体小泡包裹后与溶酶体融合，通过自噬清除，从而导致cyt-C释放减少及抑制caspase的激活，从而抑制细胞凋亡。自噬中负责调控自噬体形成的核心分子Beclin-1存在BH3结合域，能与多种Bcl-2 抗凋亡家族蛋白结合，如Bcl-2、Bcl-xL/Bcl-2L1以及Mcl-1，这种与抗凋亡家族蛋白的结合可能会对肿瘤细胞产生直接的促凋亡及抗自噬效应[45]。但是当药物作用于肿瘤细胞诱导自噬水平增高后，可能会导致Beclin-1-Bcl-2复合体或Beclin-1-Bcl-xL复合体解离，从而对肿瘤细胞产生促自噬及抗凋亡的效应[46]。进一步提示自噬的激活可能导致肿瘤细胞的抗凋亡能力增强，有利于病毒复制和延长细胞存活。由于其抗凋亡作用，NDV和自噬抑制剂的组合已成为一种增强病毒抗肿瘤潜力的新策略。

5 小 结

综上，NDV在对抗肿瘤细胞的过程中，一方面会促进溶酶体生物合成并且启动线粒体自噬-溶酶体途径，进而构成线粒体—溶酶体交互作用，对NDV感染诱导的线粒体途径凋亡有抵抗作用；另一方面能够引起细胞中的溶酶体膜发生LMP，使其内部的组织蛋白酶和水解酶释放入胞浆，进而破坏感染细胞应对NDV建立的线粒体—溶酶体交互作用，提高肿瘤细胞对NDV感染的敏感性。此外，释放的组织蛋白酶和水解酶对线粒体进一步损伤，降低线粒体膜电势，进而导致MOMP及后续线粒体凋亡发生。因此，了解溶酶体在NDV诱导凋亡和自噬的作用，可以提高NDV治疗各种癌症的治疗潜力，为今后攻克肿瘤提供理论基础。

利益冲突：无